酵母蛋白激酶Sch9激活环磷酸化状态参与热胁迫应答调控

在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,蛋白激酶Sch9已经被证明与细胞大小、胁迫应答、自噬以及寿命的调控有关.通过不同基因型酵母在固体培养基上的热敏感性研究,发现Sch9的激酶功能与热胁迫相关,进一步通过Sch9特异磷酸化位点抗体的免疫印迹,检测了细胞内Sch9关键的激活环T570位点(PDK1位点)在热胁迫条下的磷酸化状态,发现半乳糖诱导表达的Sch9在热胁迫条件下T570位点去磷酸化,首次证明了Sch9通过调控激酶活性参与细胞热胁迫应答.研究结果揭示了Sch9在胁迫应答中的部分功能,并为生理条件下Sch9调控功能的研究提供了生物化学证据.     

大气细颗粒物对CHO细胞的损伤作用及天然物质的拮抗机制

PM2.5引起的健康危害日益受到广泛关注,但其确切的损伤机理仍不完全清楚,目前也缺乏有效拮抗PM2.5损伤的天然活性物质。因此本文对北京市PM2.5造成CHO细胞的损伤作用及天然物质的拮抗作用进行研究,结果可为PM2.5污染治理和疾病的预防提供科学依据。通过CCK-8法测定细胞存活率;通过流式细胞仪测定细胞凋亡;用荧光探针DCFH-DA法测定ROS;提取细胞内总蛋白并测定其中SOD含量;以及通过Western Blot法分别测定了p-akt/akt、p65及Bad的相对表达量。结果显示:(1)10~40μg·m L-1的PM2.5可明显降低CHO细胞存活率,并呈现极显著的剂量-效应关系(r=-0.964,P0.01);15μg·m L-1PM2.5可以显著增加细胞凋亡、引起细胞内ROS增加、SOD含量下降;p-akt/akt、p65表达量增加说明Akt通路与NF-κB通路均被激活。(2)20μmol·L-1阿魏酸、50μmol·L-1绿原酸和10μmol·L-1荭草素预处理可拮抗PM2.5引起的细胞存活率下降以及细胞凋亡率增加,同时降低细胞内ROS并增加SOD含量,下调p-akt/akt、p65及Bad的相对表达量。其中20μmol·L-1阿魏酸的保护作用最佳。结果说明,PM2.5引起的CHO细胞损伤与细胞凋亡与Akt和NF-κB通路的激活有关;三种天然活性物质具有拮抗PM2.5造成的细胞损伤的能力,其保护机理是通过其降低PM2.5引起的细胞内氧化应激反应,进而降低被PM2.5激活的Akt通路与NF-κB通路和下调Bad蛋白表达量来实现的。     

文蛤甲状腺激素受体MmTR互作蛋白筛选及其对Aroclor 1254胁迫的转录响应研究

环境中存在的甲状腺干扰物(thyroid disrupting chemicals, TDCs)可影响生物体内甲状腺激素(thyroid hormone, THs)的合成、分泌、转运、代谢和作用等过程,干扰THs稳态,引起THs水平失衡。甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors, TRs)是一种存在于细胞核内的DNA结合转录因子,属于配体依赖型核激素受体超家族。TRs可与甲状腺激素响应元件(thyroid hormone response elements, TREs)结合,调控其转录表达。TDCs可作为生物体内TRs的配基,竞争性地与TRs结合,进而激活甲状腺信号通路,调控机体的整个甲状腺信号通路基因的转录表达。为探究TDCs对海洋无脊椎动物体内甲状腺激素是否具有干扰效应及其机制,本文通过构建文蛤消化盲囊组织酵母双杂交cDNA文库和文蛤甲状腺激素受体TR基因的诱饵载体pGBKT7-MmTR,在文库内进行MmTR的互作蛋白筛选和鉴定。结果表明,文蛤消化盲囊酵母双杂交cDNA文库中,cDNA片段大小在0.5～2 kb之间,库容约>2×10⁶     

伸展摇蚊(Chironomus tentans)转录组测序及胰岛素信号通路关键基因序列分析

为了探索基于胰岛素信号通路的无脊椎动物内分泌干扰性基因标志物,以伸展摇蚊(Chironomus tentans)为模式生物,在转录组测序基础上识别胰岛素信号通路中的关键基因,并针对InR、Pdk、Akt、FoxO等上游基因进行了cDNA全长扩增和氨基酸序列的多物种比对。基于该研究获取的cDNA全长序列,伸展摇蚊InR、Pdk、Akt、FoxO基因可分别编码含1 436、522、520、470个氨基酸的蛋白序列,序列同源性比对、系统发育树分析结果验证了其进化保守性。伸展摇蚊Ⅰ～Ⅳ龄幼虫、蛹、雌性成虫、雄性成虫中基因相对表达量的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明,InR、Pdk、Akt、FoxO在伸展摇蚊体内的表达趋势相似。Ⅰ龄和Ⅳ龄幼虫的基因表达峰值提示胰岛素信号在Ⅰ龄和Ⅳ龄幼虫中诱导了较快的生长发育速率;雌性成虫InR、Pdk、Akt、FoxO的表达显著高于雄性,这可能与胰岛素信号参与雌性生殖系统发育有关。     

酵母双杂交筛选OIPK相互作用蛋白

前期研究发现烟草中一个壳寡糖诱导的Ser/Thr蛋白激酶(Oligochitosan induced protein kinase,OIPK)在壳寡糖诱导的烟草抗性反应中起着重要作用.目前在烟草中发现OIPK基因的两个选择性剪接体:OIPKL和OIPKS,其中OIPKL是3个选择性剪接体中序列最长的.为进一步研究OIPK在壳寡糖诱导植物抗性中起的作用,本研究采用酵母双杂交方法,以pGBKT7-OIPKL为诱饵质粒,筛选构建在pACT2载体上的烟草cDNA文库,寻找OIPKL的相互作用蛋白.结果表明OIPKL蛋白在酵母中可以和烟草的S-腺苷甲硫氨酸合成酶、泛素激活酶E1、丙酮酸激酶、过氧化物酶相互作用.实验结果为研究壳寡糖诱导抗性机理提供了一定依据.图3参26     

拟南芥蛋白磷酸酶PPH1的结构预测与功能分析

拟南芥PPH1属于蛋白磷酸酶2C(PP2C)家族,主要参与捕光色素复合物LHCⅡ蛋白去磷酸化调控与光系统的状态转移,与STN7蛋白激酶共同参与调控LHCⅡ的磷酸化与去磷酸化.为了解此酶的具体的催化机制和空间结构,使用生物信息学的方法对PPH1的疏水性、跨膜区、膜体和二级结构进行分析,构建系统进化树并通过同源建模的方法建立其核心结构域的三级结构,围绕蛋白磷酸酶的结构和可能的作用机制关系进行探讨.在以上分析的基础上选择特异位点合成多肽后,免疫家兔并成功制备抗体.蛋白印迹结果显示制备得到了PPH1特异抗体,证实此磷酸酶结构得以正确地预测.研究为今后进一步研究其结构和功能以及突变体的设计提供了理论基础.     

基于AhR信号通路的抗雌激素效应及其机制研究进展

芳香烃受体(AhR)是一种配体依赖型转录因子,在生物体内发挥着重要的生理功能,并能够介导某些外源物质的毒性作用.已有研究表明AhR通路在调控雌性生物体生殖方面发挥着重要作用,无论AhR缺失还是AhR被过度激活均会损害雌性个体的生殖健康.近期有报道表明当AhR通路被激活后,会通过多种途径干扰生物体内源雌激素受体(ER)通路,这提示了一种外源物质发挥抗雌激素效应的新模式.本文通过归纳整理国内外相关研究,首先从AhR信号通路被激活后将会抑制雌激素(E2)合成和促进E2代谢两方面阐述了AhR激动剂降低雌性个体内源E2水平的作用途径,接着又从活化的AhR通路直接抑制雌激素效应基因的转录、与ER通路竞争共调控因子和促进ER降解3个角度总结了AhR激动剂拮抗ER功能的分子机制,以期为相关物质的抗雌激素机制研究提供借鉴与参考.     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

PCBs暴露ApoE-/-小鼠肝脏的microRNA和mRNA调控网络研究

本研究通过microRNA-mRNA相互作用考察PCBs的基因毒性,探讨PCBs致动脉粥样硬化可能的分子机制.研究使用8周龄ApoE-/-小鼠,腹腔注射PCBs混合物Aroclor1254(55 mg·kg-1体重),暴露6周后获取其肝脏,提取总RNA,获取cDNA或对RNA去磷酸化及特征标记.采用Affymetrix GeneChipMouse Genome430 2.0基因芯片和Agilent Mouse microRNA array芯片,分析Aroclor1254暴露前后mRNAs和miRNAs的差异表达情况.随后,结合Affymetrix mRNA芯片平台,使用IPA软件分析差异表达的miRNAs和mRNAs,揭示Aroclor1254暴露对基因调控网络和信号通路的影响.研究结果显示,Aroclor1254暴露后有18个差异表达的miRNAs能够靶向调控110个差异表达的mRNAs,二者可共同影响糖代谢、脂代谢、细胞死亡、分子运输等生物学功能.进一步考察与动脉粥样硬化发生发展密切相关的糖代谢、脂代谢网络调控,发现miRNA-22、let-7family、miRNA-15a/b,以及靶基因PPARα、PPARγ辅助激活因子1α和Foxo1,在PCBs暴露致动脉粥样硬化发生发展的糖脂代谢异常中发挥了重要作用.     

氯氰碘柳胺钠通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2诱导RAS突变型肺癌细胞衰老和死亡

含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)具有调控细胞增殖分化、维持周期、调节免疫等功能,与众多肿瘤的发生发展密切相关. SHP2是RAS蛋白(ratsarcoma protein,RAS)信号通路的重要调控蛋白,研究表明抑制SHP2活性能减缓RAS突变肺癌的进展. 因此筛选特异性的SHP2抑制剂,有助于为肺癌的治疗提供新的手段. 通过建立不同蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)体外筛选体系,从化合物文库中筛得SHP2特异性抑制剂氯氰碘柳胺钠(closantel sodium,CS),其IC₅₀值为84.83 μmol/L. 采用Western Blot检测CS对SHP2磷酸化的抑制作用;采用细胞热转移试验(cellular thermal shift assay,CETSA)检测在不同温度及浓度下CS对SHP2的热稳定性的影响;采用CCK8检测CS对人肺癌细胞A549、NCI...     

非生物胁迫对盐生杜氏藻DsMPK转录、翻译和磷酸化修饰的影响

促有丝分裂活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK或MPK)途径是在真核生物中广泛存在的调控多种生理过程的信号途径,在细胞增殖、分化、凋亡、生物和非生物胁迫等生理过程的调控中起着关键的作用.盐生杜氏藻(Dunaliella salina,盐藻)是目前世界上最耐盐的真核光合生物之一.在前期实验中,已发现盐藻MAPK(DsMPK)的表达受到低温和高盐胁迫的抑制.分析DsMPK在高温、低盐、氧化、紫外胁迫中的表达变化,发现DsMPK还受到氧化胁迫的抑制.进而分析DsMPK在高温、低盐、氧化、低温、高盐和紫外胁迫中翻译和磷酸化修饰的变化,发现除低盐胁迫外,在磷酸化修饰水平DsMPK同样受到各种非生物胁迫的抑制.在对不同生长阶段盐藻DsMPK磷酸化变化的分析中还发现,DsMPK的磷酸化水平与生长速率有一致性.各方面DsMPK的变化趋势说明其为一调控生长相关的MAPK.     

甘薯蔗糖转运蛋白IbSUT1x在酵母细胞中的定位

蔗糖转运蛋白是植物特有的一类载体蛋白,酿酒酵母突变株SUSY7/ura3常被利用来研究蔗糖转运蛋白的功能,但在研究中发现,有的蔗糖转运蛋白在酵母中未表现出蔗糖转运的功能.但这或许并不是其实际功能的体现,而是由于这类蛋白无法准确定位到酵母的细胞膜上造成的.IbSUT1x是本实验室从甘薯中分离到的一个蔗糖转运蛋白基因,但是在SUSY7/ura3中未表现出明显的蔗糖转运功能.本研究通过用激光共聚焦显微镜对IbSUT1x与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的融合蛋白的表达和定位的观察,发现IbSUT1x不仅在酵母细胞中有表达,而且表达的蛋白质定位在酵母的细胞膜上.结果表明,IbSUT1x在酵母细胞中不能转运蔗糖,该蛋白很可能不具有蔗糖转运功能,或者其与蔗糖的亲和力很低.     

毒死蜱低剂量重复染毒致学习记忆功能障碍及CREB信号途径的抑制(Repeated Exposures to Low-Level Chlorpyrifos Result in Learning Memory Impairment and Inhibition of the CREB Signal System)

毒死蜱(CPF)是我国推荐使用的低毒有机磷农药之一,目前在全世界广泛应用.选择不引起动物出现全身系统毒性的CPF剂量(1、5、10mg·kg-1)对大鼠连续染毒4周,评价CPF对动物的学习记忆功能和CREB信号通路的影响.结果显示:CPF连续染毒后动物出现记忆能力的损伤,随着染毒剂量的增加,海马、皮质和纹状体CREB及ERKI/Ⅱ磷酸化蛋白表达逐渐减少,这表明ERK/CREB信号通路可能是参与毒死蜱低剂量重复暴露致学习记忆功能改变的重要途径.     

重组植酸酶appAM8的异源表达与性质比较

为比较在不同宿主中表达的大肠杆菌植酸酶突变体app AM8的性质,将app AM8基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中进行表达,对纯化后的植酸酶进行酶学性质分析与比较.结果显示:(1)在大肠杆菌中表达的app AM8(E-app AM8)和酵母中表达的app AM8(P-app AM8)的最适p H值均为4.5,最适反应温度均为65℃,与野生型的app A的最适p H无明显区别,比app A的最适温度高了5℃;(2)经SDS-PAGE检测,E-app AM8分子量(Mr)大小为47×103,而P-app AM8为53×103左右,由于在酵母中的糖基化修饰电泳显示为两条带;(3)在60-80℃之间,E-app AM8的热稳定性性明显下降,而且在70℃处理15 min后,E-app AM8残余活性仅为4%,而P-app AM8仍保留50%的残余活性,表明酵母表达的植酸酶经过糖基化修饰后提高了酶的热稳定性.(4)E-app AM8的Km=0.245 mmol/L,Vmax=3196 U/mg,P-app AM8的Km=0.36 mmol/L,Vmax=3333 U/mg.本研究表明,糖基化修饰对植酸酶app AM8的热稳定性起着重要作用,8个位点的突变对该植酸酶的稳定性也起到了一定作用.     

复杂网络用于取代苯类内分泌干扰物的毒性通路

内分泌干扰物可干扰机体的信号途径,影响动物和人体正常的激素平衡,其信号转导途径非常复杂,涉及多条信号通路的激活.本文通过复杂网络技术构建了乙草胺、地散磷等20个取代苯类内分泌干扰物与71个有效靶标的相互作用网络,分析其网络的拓扑系数后获得6个基因作为网络的中心节点基因并带入KEGG信号通路数据库.通过复杂网络预测取代苯类化合物可通过与靶标基因ESR2和MMP9的作用影响雌激素信号通路;通过与靶标基因HIST3H3和MMP9的作用影响前列腺癌及多发性骨髓癌的误转录调节通路,其中,多发性骨髓癌误转录通路可能是取代苯类内分泌干扰物毒性作用的一条新的信号通路.“复杂网络”技术的应用有助于从基因/基因的角度出发,将化合物和机体信号通路相互联系,探讨取代苯类内分泌干扰物对机体的毒性机制,基于整体评价内分泌干扰物对机体的毒性作用,为环境污染物的研究提供了一种新的手段.     

麻疯树小热激蛋白基因JcHSP15.9的原核表达及耐热胁迫

小热激蛋白(sHSPs)是植物在逆境条件下产生的一类具有分子伴侣活性的应激蛋白,本研究拟构建原核表达载体并表达具生物学活性的麻疯树小热激蛋白以进一步研究其功能及应用.从麻疯树胚乳cDNA文库中获得全长为652 bp的cDNA序列,包含一个426 bp的开放阅读框,编码分子量大小约为15 926.13的胞质Ⅰ型小热激蛋白,命名为JcHSP15.9.通过构建原核表达载体,得到BL21(DE3)plysS/pET32a-HSP重组菌株.用JcHSP15.9在大肠杆菌中的过量表达来研究它的耐热胁迫能力,发现在常温(37℃)下重组菌株与野生型菌株生长曲线基本相似,但在高温(50℃)下重组菌较对照组菌株存活率有了显著的提高,推测JcHSP15.9可能与麻疯树的耐热胁迫有关.通过镍亲和层析柱纯化得到纯度较高的JcHSP15.9蛋白,分子量大小与预期一致,蛋白条带单一清晰.     

铅暴露U251细胞差异表达基因及相关通路(The Interrelated Pathways in Brain Human U251 Glioma Cells by Lead Exposure)

为探讨铅对体外培养的人神经胶质瘤U251细胞(human U251glioma cells,U251)暴露后基因表达的变化以及相关基因通路,选用乙酸铅暴露U251细胞.细胞在乙酸铅中暴露8h和24h后提取RNA,使用cDNA芯片分析基因表达情况,芯片扫描结果经归一化处理,设定Ratio值<0.5或≥2.0为表达有差异基因.结果表明,铅暴露U251细胞导致2840条基因差异表达,使用KEGG和BioCarta数据库分析代表性基因网络.结果发现,铅暴露U251细胞导致大量基因差异表达,涉及多个代谢及信号通路,与神经组织相关的主要信号通路有Ca2+信号通路、Jak-STAT信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路等,还涉及配体-受体、细胞因子相互作用等.这些通路相互联结,构成复杂的网络系统,调控细胞的生物学功能.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻负调控抗病基因OsEDR1及基因功能分析

拟南芥EDR1(Enhanced Disease Resistance1),一个Raf样MAPKKK蛋白激酶,通过级联蛋白激酶途径MKK4/MKK5-MPK3/MPK6负调控水杨酸诱导的免疫防卫反应.为研究水稻OsEDR1基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术创制OsEDR1的功能缺失突变体的同时,构建过表达载体p TCK303-Ubi-OsEDR1转化水稻,获得转基因植株,最后接种白叶枯病菌.此外,也构建pBI1.4t-35S-OsEDR1表达载体并转化拟南芥,分析转基因植株的白粉菌抗病性.结果表明利用CRISPR/Cas9技术创制了单碱基插入的OsEDR1功能缺失突变体;白叶枯病原菌Xoo PXO99的接种实验表明,该功能缺失突变体与日本晴相比,病斑长度减少约50%,增强了水稻对Xoo PXO99的抗性.定量PCR和接种实验结果显示在日本晴中过量表达OsEDR1增强了水稻对Xoo PXO86的感病性.在拟南芥edr1突变体中异源表达OsEDR1无法抑制edr1突变体对白粉菌的抗病和白粉菌诱导的细胞死亡.综上所述,OsEDR1负调控水稻对白叶枯的抗病反应和自发的细胞死亡,可能与拟南芥所依赖的防御反应信号通路不同相关;结果可为下一步深入研究EDR1基因的作用机制和在水稻育种中的应用提供参考.(图4表1参29)     

五氯酚对斑马鱼胚胎发育期Wnt信号通路的影响

为从毒理基因组学角度探讨五氯酚(PCP)发育毒性的作用机制,将0hpf斑马鱼(Danio rerio)胚胎暴露于50μg·L-1PCP中8h,提取其总RNA,与Affymetrix公司的斑马鱼寡核苷酸芯片杂交.结果发现,与对照组相比,染毒样本中,1149个基因的表达显著增强(log2ratio>1),501个基因的表达显著减弱(log2ratio<-1).利用生物信息学软件GenMAPP对差异表达基因进行了Wnt信号通路分析,结果显示,PCP暴露后斑马鱼胚胎发育过程中fzd2、axin2等Wnt信号通路重要的调控基因表达均发生了显著变化;PCP影响了经典Wnt通路和非经典Wnt通路,并可能影响了Wnt通路与FGF通路的相互作用.     

Wnt信号通路对铅暴露引起的斑马鱼胚胎发育毒性的影响

铅是环境中常见的污染物,为探讨Wnt信号通路在铅暴露引起的胚胎发育毒性中的作用,将斑马鱼胚胎随机分为10组,每组100个,以铅(0、6、12、24、48μmol/L)和Wnt信号通路的激活剂HLY78(5μmol/L)单独及联合处理斑马鱼胚胎4-144 h,利用实时定量PCR技术进行分析.结果显示,铅单独暴露能够引起wnt3a表达量降低,而HLY78处理能够抑制wnt3a表达量的进行改变,修复Wnt信号通路.利用EthoVision XT软件获取并分析斑马鱼的自主运动、心率和运动行为等毒性试验的有效参数.与对照组相比,单独铅暴露组可致斑马鱼胚胎死亡率和畸形率增高,以及孵化率、心率和仔鱼平均活力降低(P0.05);加入Wnt信号通路的激活剂HLY78,与单独暴露组相比,死亡率和畸形率显著降低,孵化率、心率和仔鱼平均活力显著升高(P 0.05).各组间胚胎的自主运动没有显著差异.本研究结果表明铅暴露可影响斑马鱼胚胎的发育,使用HLY78激活Wnt信号通路能够显著地缓解铅暴露诱导的这些影响,预示破坏Wnt信号通路可能与铅诱导的发育毒性相关.(图5参28)