一株菲降解菌的分离鉴定及其降解条件研究

以菲为研究对象,从克拉玛依稠油污染土壤中筛选到1株对菲具有较好降解效果的菌株JZ3-21。通过形态观察、生理生化指标及16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定。该株菌的16S rDNA序列与Pseudomonas属的相似性达99%,结合分离菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列的分析结果,初步鉴定该菌株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida.）。对其降解条件进行了研究,结果表明：在40℃,pH 8.0,接种量为1.5%的条件下,菌株对初始质量浓度为100 mg.L-1的菲在64 h内的降解率高达94.2%。该菌对高质量浓度菲有较好的耐受性,其最高耐受质量浓度可达2 000 mg.L-1。     

3株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定

从云南温泉的污泥样品中分离到3株产蛋白酶的高温菌SB11、SB31和SC5,通过其形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析等,初步鉴定这3株菌都属于土芽孢杆菌属(Geobacillus),其最适生长温度为60℃,最适pH为6.三者的蛋白酶活力分别可达35.6、26.1和26.6UmL-1,最适酶反应温度都在70℃以上,其中菌株SB31的蛋白酶其最适酶反应温度高达80℃,远高于一般动植物来源的蛋白酶.图4表1参11     

两株吡啶降解菌的分离与鉴定

为了研究石油污染土壤中含氮杂环化合物的降解情况,该研究选择吡啶作为目标污染物,采用选择性富集培养的方法,从45份石油污染土壤样品中,分离得到260株降解吡啶污染物的高效降解菌株,选择降解效率最高的2株吡啶降解菌命名为菌株4-11和2-13,进行种属鉴定、细菌的生长情况和吡啶降解性能的考察.实验证明,60 h菌株4-11和2-13对质量浓度为1000 mg·L-1吡啶的降解率分别达到65.5%和64.1%.通过形态学、生理生化鉴定和16S rDNA序列比对分析,确定菌株4-11属于产硫酸杆菌(Thiobacillus)与Thiobacillus intermediu 同源性最高,为99.8 %,菌株2-13属屈挠杆菌(Flexibacter)与 Flexibacter giganteus同源性最高,为99.9 %.     

甲基营养型芽孢杆菌的分离鉴定及在防蝇产蛆环境防治中的应用

从华南农业大学试验基地土壤筛选芽孢杆菌,得到17株芽孢杆菌,结合插入序列指纹图谱对分离获得的芽孢杆菌进行聚类分析,共分为3个类群;测定各类群代表菌株的16S rDNA序列,分析其系统发育,结果表明类群Ⅰ代表菌株RF2与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus CBMB 205~T)相似性为99.48%;类群Ⅱ代表菌株RF10与好氧芽孢杆菌(Bacillus aerophilus 28K~T)相似性为99.61%;类群Ⅲ代表菌株RF16与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC14579~T)相似性为99.87%.餐厨垃圾试验表明类群Ⅰ RF2具有餐厨垃圾防蝇产蛆效果;并且生理生化、碳源利用以及抗菌谱试验表明菌株RF2在碱性条件下可以将葡萄糖分解成丙酮酸并脱羧氧化生成二乙酰,既能够将氨转化为氨基酸和胞内其他含氮化合物,也利用多种碳源供自身生长,能够拮抗多种植物病原菌(水稻纹枯病、尖刀廉孢菌、香蕉枯萎病).而RF2在含有难溶性的磷酸盐[Ca_3(PO_4)_2]条件下可分泌出有机酸降低pH值,使难溶性磷酸盐溶解供自身利用.因此本研究获得的菌株RF2是一株具有较强促生作用和应用于防蝇产蛆的芽孢杆菌,具有很好的应用前景.     

近海养虾场底泥中产芽孢细菌的生态特征

通过对近海养虾场底泥中的细菌数量和类群的调查，发现有超过50％的细菌生物量是产芽孢细菌，因此对底泥中的产芽孢细菌进行了分离和纯化，通过对细胞形态、生理生化等特征的研究和对部分菌株的16S rRNA基因的ARDRA分型、序列分析等，鉴定了67株产芽孢细菌，其中62株属于芽孢杆菌属，5株属于短芽孢杆菌属．进一步对62株芽孢杆菌属的细菌在底泥不同深度的分布进行研究，结果表明，巨大芽孢杆菌主要分布在底泥深度0～6cm左右的区域，海洋芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌主要分布于底泥6cm以下的区域，与坚强芽孢杆菌性状相近的菌分布在底泥2～8cm深度；与耐碱芽孢杆菌性状相近的芽孢菌广泛分布在0～12cm区域．讨论认为，应用这些产芽孢细菌资源在修复海洋环境和开发海水养殖微生态制剂方面具有一定可能性．图3表3参15     

微生物絮凝剂生产菌T1的鉴定及其对生活污水絮凝特性

从活性污泥中分离筛选絮凝剂产生菌,得到一株对高岭土悬浊液具有较高絮凝活性的微生物絮凝菌T1.根据菌株的生理生化鉴定以及16S r DNA基因序列分析,确定该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp),该菌的絮凝活性物质分布在发酵液上清液中.通过正交实验确定最佳生活污水絮凝条件为絮凝剂投加量5%,污水p H值7.0,助凝剂Ca Cl2投加量为2%,在此条件下,T1发酵上清液对生活污水的絮凝率为83.85%.     

干扰素废水菌种的筛选与产酶特性

针对干扰素废水具有抑制性导致活性污泥驯化培养难的问题,利用稀释涂布、富集培养的方法从干扰素废水中筛选出5株高效菌株,分别为IFN1~IFN5。观察5株高效菌种的菌落形态,经16S rDNA测序鉴定其中2株菌株为假单胞菌,2株菌株为索氏菌,1株为不动杆菌。完成了5株高效菌种的生理生化实验,分析其酶代谢系统:IFN1可产生蛋白酶和色氨酸酶;IFN2可产生过氧化氢酶、色氨酸酶和蛋白酶;IFN3可产生过氧化氢酶、色氨酸酶、蛋白酶和淀粉水解酶;IFN4可产生过氧化氢酶、蛋白酶和淀粉水解酶;IFN5可产生过氧化氢酶、蛋白酶。本研究为后续针对降解干扰素废水诱导酶的提取奠定基础。     

低温纤维素降解菌的分离与鉴定

对内蒙古部分地区土壤中低温降解纤维素的微生物进行研究,以期获得一些高酶活的低温纤维素酶产生菌.采用纯培养的方法,在10℃下培养获得纯培养物.以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增后进行序列同源性比对确定种属.以DNS法测定纤维素酶活性,并对酶活较高的菌株进行产酶条件的优化.结果共分离得到55株可低温降解纤维素的菌株,16S rDNA序列分析表明它们分别属于γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及β-变形菌纲(β-Proteobacteria).该55株菌的纤维素酶活性均在22℃下最高.其中菌株CF11在10℃下的酶活在分离得到的55株细菌中最高.通过优化,菌株CF11产纤维素酶的最佳条件初步确定为pH值为6.5,培养时间为10 d,并且是以酵母提取物作为氮源,其纤维素酶活为58.091 IU.因此菌株CF11是一株极具开发潜力的低温纤维素酶产生菌.     

几株紫色非硫细菌的分离鉴定与产氢特性分析

从重庆地区不同环境淤泥、泥水样品中,经富集培养、分离纯化,获得5株紫色非硫细菌.根据菌体的菌落形态、染色特性、生理生化特征及活细胞光吸收峰对菌株进行常规鉴定,结合菌株16S rDNA扩增测序进行分子生物学分析验证,构建了菌株与数据库中近缘菌株的系统发育树.以优化的培养条件(营养、pH、接种量等参数)对供试菌株的生理生化特性和产氢能力做了比较分析.结果显示,5个菌株均为光合产氢细菌,菌株ANI、D1为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris),AN2、AS1、BS1等3株为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides);其中类球红细菌菌株AN2在给定的培养条件下光合产氢能力最高,可达9.55μg/mL d-1,是一株有应用前景的光合产氢细菌.图4表2参15     

一株聚丁二酸丁二醇酯降解菌的分离鉴定

以聚丁二酸丁二醇酯（PBS）为唯一碳源,通过滤纸片法对西安郊区土壤中可有效降解PBS聚合物的微生物进行分离,并成功获得一株降解效果最为明显的细菌菌株,其在30 d内可使PBS聚合物的数均分子量降低19.80%。采用生理生化实验以及16S rDNA序列对比分析对该菌株进行了鉴定。结果表明,该菌株的生理生化特征与铜绿假单胞菌属相似,且其16SrDNA序列与Pseudomonas aeruginosa 39016 contig 00492的核苷酸序列同源性达99%,结合生理、生化指标鉴定结果,进一步确定该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudanonas aeruginosa）。该菌株的分离鉴定为进一步研究PBS聚合物的生物降解特性及机理等奠定了基础。     

一株耐受糠醛的纤维素降解菌Bacillus siamensis BREC-11的分离与鉴定

糠醛是木质纤维素转化过程中产生的有毒的代谢抑制物,能阻碍菌株正常发酵,增加发酵成本.为提高发酵菌株耐受糠醛的能力,促进对木质纤维素的高效转化,以糠醛为耐受物添加到培养基中,竹虫幼虫肠道作为分离源,经刚果红染色法初步筛选,分离到一株可耐受糠醛的纤维素降解菌株BREC-11;通过形态学观察、生理生化分析、细胞化学分析、16S rDNA序列比对等多相分类学方法鉴定;进一步进行了不同浓度糠醛耐受试验研究,并测定菌株的滤纸酶活(FPA)、CMC酶活、纤维二糖酶活(β-G).确定菌株BREC-11属于芽孢杆菌属的一个种,将其定名为Bacillussiamensis BREC-11.菌株BREC-11在含3.5 g/L糠醛的培养基中可以生长;在3.5 g/L糠醛的耐受浓度下,在30℃、150 r/min培养2 d后,滤纸酶活达到0.1 U/m L,CMC酶活达到0.21 U/m L,纤维二糖酶活达到0.07 U/m L.本研究表明BREC-11是一株耐受糠醛的纤维素降解菌株,在生物炼制过程中具有一定的应用潜力.     

贵州浓香型白酒大曲中霉菌的18S rDNA系统发育分析

从贵州某名酒厂大曲中分离到104株丝状真菌(霉菌),通过形态特征和生理特性检测等传统鉴定方法,初步把形态和生理生化特征一致的霉菌归类为14个大类群;并采用18S rDNA序列分析,进一步把菌株归类为MJ-I至MJ-V五个类群,随后构建系统发育树.结果表明,样品中的霉菌以曲霉属(Aspergillus)为主,占总分离菌数...     

响应面法优化短小芽孢杆菌SCU11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析

短小芽孢杆菌SCU11是由本实验室分离的野生菌株BA06经过复合诱变得到的高产碱性蛋白酶菌株,其产生的碱性蛋白酶在生物制革领域具有很好的应用前景.为进一步提高菌株的蛋白酶产量以满足工业生产的需求,本研究利用响应面法优化菌株产蛋白酶的发酵培养条件.在前期单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman实验设计、最陡爬坡实验、中心组合实验设计和响应面分析法,确定了当黄豆粉浓度为53.3 g/L,温度为28℃时,蛋白酶活有理论最大值8 884 U/m L,摇瓶实验验证酶活为8 768 U/m L,达到理论预测值的98.7%,比优化前酶活提高了1倍.为了解优化的发酵条件使蛋白酶产量提高的原因,对短小芽孢杆菌蛋白酶基因及相关调控基因的表达情况进行荧光定量PCR分析,结果显示,优化后5种蛋白酶基因的表达量上调,1种表达量下调;5种蛋白酶相关调控基因的表达量增加,2种基因表达量降低.推测是优化后正调控基因表达量的增加以及负调控基因表达量的降低,促进了短小芽孢杆菌胞外蛋白酶基因转录水平的提高,导致胞外蛋白酶产量增加.本研究采用响应面法优化发酵条件使短小芽孢杆菌SCU11蛋白酶产量提高了1倍,并为阐明其表达调控机制奠定了基础.(图3表7参24)     

不同生境产脂肪酶菌株的筛选及多样性

为发掘不同特性脂肪酶微生物资源,采用纯培养方法从青海高寒草地、雅安山区、成都平原分离得到产脂肪酶菌株54株.通过对菌株的DNA进行ERIC-PCR指纹图谱分析,按聚类树划分为5个操作分类单元.16S rDNA序列测定和聚类分析显示,分离菌株分布于芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobacter).多样性分析表明,与青海高寒草地、雅安山区相比,成都平原产脂肪酶菌株遗传多样性更为丰富.在54株菌中都出现了300 bp和1 300 bp两个特异且稳定出现的条带,这两个特异条带可能是产脂肪酶菌株的SCAR标记条带.     

两株芽孢杆菌降解羽毛比较及抗氧化肽分离

枯草芽孢杆菌UMU4和短小芽孢杆菌SCU11是四川省分子生物学及生物技术重点实验室分离的野生菌株经诱变获得的胞外蛋白酶高产菌株,其分泌的蛋白酶在蛋白废弃物处理方面具有良好的应用前景.为了从这两株芽孢杆菌中筛选出高效利用羽毛的最优菌株,将UMU4和SCU11分别接种到羽毛培养基中并持续发酵6 d,通过每天测试羽毛降解率、可溶性多肽含量、氨基酸含量、蛋白酶活及抗氧化活性等指标来评价这两株菌对羽毛的降解能力.结果发现SCU11能更高效地利用羽毛,其羽毛降解率是UMU4的1.2倍,第5天时约有65%的羽毛转化为可溶性肽和氨基酸;SCU11发酵液的ABTS自由基清除率和还原力均在第3天达到最大值,且显著高于UMU4羽毛发酵液的抗氧化活性;SCU11在第5天所产角蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别是UMU4的1.6和1.2倍.在此基础上,将来自于SCU11的羽毛降解产物经HCl沉淀和疏水层析获得了4个抗氧化肽组分,其中组分F3的抗氧化活性最高.本研究表明芽孢杆菌SCU11较之UMU4具有更高的产酶活性及更强的羽毛降解能力,结果可为家禽羽毛的资源化应用奠定基础.     

抗真菌多肽——捷安肽素高产菌的选育

从新疆棉株上分离得到一株细菌ZK ,经培养物性状和生理生化鉴定 ,确定该菌为芽孢杆菌属 (Bacillussp.)菌 ,其代谢产物为一种抗病原真菌的肽类物质———捷安肽素 .以此株菌作为出发菌株 ,进行紫外线、微波和亚硝基胍诱变 ,诱变处理后获得高产突变株Mv2 8,在摇瓶试验中 ,该变异株产捷安肽素活性比出发菌株提高 31.6 % .图 5表 5参 12     

华重楼内生菌Iun35的分离及其抗菌蛋白的性质

从华重楼(Paris polyphylla Smith var.chinensis)块茎中分离纯化得到一株具有较强抑菌活性的内生细菌Iun35,经形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将分离得到的Iun35菌株发酵培养,培养液上清经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白UD35.用该蛋白对多种植物病原菌进行拮抗测定,结果显示,UD35对玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuha)、小麦赤霉病菌[Gibberelle zeae(Schw.)]等多种菌有强烈抑制作用.测定其相对分子质量约为55 000,氨基酸分析结果表明其由17种氨基酸组成.图3表4参16     

甲基营养型芽孢杆菌H0对羽毛产寡肽的降解特征

寡肽具有较高的营养价值和多种生理功能,筛选高产寡肽的羽毛降解菌株,并将其用于羽毛寡肽的生产,对高效利用废弃羽毛资源、提高产品附加值具有重要意义.以寡肽产率为评价指标,从16株羽毛降解菌中分离到一株高产寡肽的羽毛降解菌H0,通过形态观察、生理鉴定和系统发育分析,初步鉴定菌株H0为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus).对其降解羽毛产寡肽特性和羽毛寡肽特征进行初步探究,发现该菌在最佳初始pH(11)和最佳温度(40℃)下发酵72 h,羽毛几乎完全降解,寡肽产率达38.19%(占可溶性总肽的67.53%),同时检测到11.11%的游离氨基酸.液质联用(LC-MS/MS)分析结果表明所产寡肽的分子量(Mr)主要分布在1 300以下,且主要是由5-10个氨基酸组成的短肽,富含支链氨基酸,推测其是羽毛降解液呈现抗氧化活性的主要原因.本研究表明甲基营养型芽孢杆菌H0具有较强的降解羽毛产寡肽能力,可为羽毛寡肽产品的开发提供优质微生物资源和科学依据.     

短小芽孢杆菌胞外蛋白质组双向电泳分析及碱性胁迫下胞外差异蛋白鉴定

短小芽孢杆菌Bacillus pumillus SCU11是本实验室从富含蛋白质的生活垃圾中分离并诱变得到的具有高碱性蛋白酶活性的菌株,其分泌的碱性蛋白酶具有很好的生皮脱毛效果,在生物制革工业具有良好的应用前景.短小芽孢杆菌胞外蛋白质多达数百种,为了解其组成情况,采用LB培养基培养短小芽孢杆菌SCU11,以三氯乙酸/丙酮法沉淀发酵上清液中的蛋白质,通过双向电泳分析,建立了具有较高分辨率的短小芽孢杆菌胞外蛋白的双向电泳图谱.在此基础上,分析了碱胁迫条件下短小芽孢杆菌胞外蛋白质的双向电泳图谱,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定了10个差异蛋白点,其中有5种为胞外分泌蛋白,包含2种胞外蛋白酶.本研究结果表明与呼吸作用及运动相关的蛋白可能参与了短小芽孢杆菌碱胁迫的应答反应.     

一株产木聚糖酶嗜热真菌樟绒枝霉的鉴定及其产纤维质降解酶系分析

对分离得到的一株产耐热木聚糖酶的真菌CAU521进行鉴定,并对其产纤维质降解酶系进行研究.通过菌落形态、显微镜产孢结构以及18S rDNA序列同源性比对等分析,鉴定该菌为樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea),其最适生长温度为45℃,为一株嗜热真菌.该菌能以农业废弃物玉米芯为碳源液体发酵产耐热木聚糖酶,50℃下培养7 d,木聚糖酶的最高酶活力达到173 U/mL.SDS-PAGE和酶谱分析表明该菌株能同时分泌多种纤维质降解酶:4种木聚糖酶、2种纤维素酶、3种葡聚糖酶和1种甘露聚糖酶.结果表明樟绒枝霉CAU521在降解和利用纤维质材料方面具有潜在的应用价值.