美国红鱼卵黄原蛋白的分离纯化及电泳性质鉴定

腹腔注射0.02mg/gBW17β-雌二醇,诱导美国红鱼1wk后取尾静脉血,离心分离得到的血浆经Sephacryl S-300 high resolution分子筛分离、纯化卵黄原蛋白.常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色和糖、磷、脂的特征性基团染色结果表明,17β-雌二醇诱导美国红鱼产生了两种形式的卵黄原蛋白,以Native-PAGE方法计算出美国红鱼两种卵黄原蛋白的分子量分别为344×103和247×103,以SDS-PAGE方法得出卵黄原蛋白3种亚基的分子量为152×103、133×103和118×103.分子筛凝胶过滤能较好地分离纯化美国红鱼血浆中的卵黄原蛋白.图8参17     

短小芽孢杆菌胞外蛋白质组双向电泳分析及碱性胁迫下胞外差异蛋白鉴定

短小芽孢杆菌Bacillus pumillus SCU11是本实验室从富含蛋白质的生活垃圾中分离并诱变得到的具有高碱性蛋白酶活性的菌株,其分泌的碱性蛋白酶具有很好的生皮脱毛效果,在生物制革工业具有良好的应用前景.短小芽孢杆菌胞外蛋白质多达数百种,为了解其组成情况,采用LB培养基培养短小芽孢杆菌SCU11,以三氯乙酸/丙酮法沉淀发酵上清液中的蛋白质,通过双向电泳分析,建立了具有较高分辨率的短小芽孢杆菌胞外蛋白的双向电泳图谱.在此基础上,分析了碱胁迫条件下短小芽孢杆菌胞外蛋白质的双向电泳图谱,利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定了10个差异蛋白点,其中有5种为胞外分泌蛋白,包含2种胞外蛋白酶.本研究结果表明与呼吸作用及运动相关的蛋白可能参与了短小芽孢杆菌碱胁迫的应答反应.     

三叶虫茶茶多酚提取工艺研究

研究萃取-沉淀法从虫茶中提取分离茶多酚的影响因素.采用单因素循环法考虑各影响因素,得出三叶虫茶茶多酚的最优提取工艺.用回流法提取茶多酚,并用单因素循环法分别考察提取剂、沉淀剂、转溶酸、萃取次数对茶多酚提取率的影响,用紫外-可见分光光度法对提取液进行检测.用萃取-沉淀法从虫茶中提取分离茶多酚,以80%丙酮作提取剂,Zn Cl2作沉淀剂,盐酸转溶的效果较为理想.结论表明,萃取-沉淀法提取分离虫茶中茶多酚,所需要的有机溶剂少,能耗低,纯度高,具有可行性.图4,表5,参14.     

干燥和复吸水条件下发菜过氧化物氧还蛋白差异表达与基因克隆

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,为探讨其耐旱的分子机理及对极端干旱环境的适应和保护机制,运用双向电泳技术(2-DE)、凝胶图像分析、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜过氧化物氧还蛋白(Peroxiredoxin)在持续干燥48 h和复吸水4 h后的差异表达水平,根据鉴定的过氧化物氧还蛋白已知氨基酸序列设计简并性引物克隆该基因,分析基因和氨基酸序列的同源性及对蛋白质二级结构进行预测,并研究其原核表达.结果表明,发菜过氧化物氧还蛋白在复吸水后的表达量明显高于干燥状态下的表达量。根据简并性引物克隆获得长度为639 bp的过氧化物氧还蛋白基因,GenBank登陆号为HM854286.序列比较分析显示该基因具有较高的保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲构成.将过氧化物氧还蛋白基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白(26.5×103),经Western blotting验证,该外源蛋白为过氧化物氧还蛋白.图10表1参25     

水稻叶片蛋白质组双向电泳实验条件的改进

为获得高分辨率、高灵敏度的2-DE图谱,以3叶1心期的水稻幼苗叶片为研究材料,对蛋白样本的制备、上样量及考马斯亮蓝R-250染色等关键步骤进行探讨,优化实验条件.结果表明,脱色后凝胶经5%冰乙酸浸泡后得到的2-DE图谱蛋白质点明显增多,图谱背景清晰.同时,不同公司考染试剂CBB R-250染色灵敏度存在较大的差别,应予以尝试.同其它方法相比,本方法简便、稳定,灵敏度高,可操作性强,对水稻蛋白质组学研究具有一定的指导意义.     

金针菇中蛋白质含量的变化和其中一个蛋白质的生物活性

在对金针菇(Flammulinavelutipes)子实体活性蛋白质纯化过程中发现,金针菇在不同环境条件下不同蛋白质的表达量有差异.通过阴离子交换层析、凝胶层析和高压液相色谱,从金针菇中分离纯化获得了一种蛋白质Zb.经SDS-PAGE测定该蛋白分子量(Mr)为 30×103,等电聚焦电泳表明该蛋白质的等电点为 4. 7,且该蛋白质不含糖.N-端测序表明,该蛋白质N-端的 20个氨基酸为PQVKTSWEDLANLGWPIQQV.此外,在HepG2. 2. 2. 15细胞株上检测该蛋白质体外对肝炎病毒的抑制作用,发现对HBsAg抑制作用明显,抑制中浓度为 0. 117μg/mL,但对HBeAg几乎无作用.以胃癌细胞株MGC80-3为研究对象,检测表明,该蛋白质对MGC80-3抑制率在 50%时的蛋白质浓度约为 0. 75μg/mL.以起始浓度为 0. 296mg/mL的Zb检测它的血凝活性时发现,Zb对兔血红细胞和人A、B、O血红细胞的血凝滴度为 2-12.但同时观察到Zb处理后的兔血红细胞形态发生改变. 图 6表 1参 15     

家蝇抗菌蛋白的分离纯化及部分性质

通过体壁损伤诱导家蝇（Musca domestica)幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性、减压蒸馏浓缩、Sephadex G-15柱脱盐、CM-Sepharose离子交换层析、Sephadex G-50凝胶过滤等步骤,分离得到一种具抗菌活性的蛋白质,并达电泳纯,结果表明,分离物不具血细胞凝集活性,也不是溶菌酶,而是一种未见报道的抗菌蛋白,经SDS-PAGE测得,该抗菌蛋白Mr=12600,等电点为9.8。     

一种提取富含油脂植物组织总RNA的改良SDS酸酚法

采用常规的方法提取富含油脂的植物组织总RNA常难以取得满意的结果.对林莎两次裂解法进行了改良,即将SDS的浓度降低至1%,所用酸酚的pH值降低至4.0,去掉提取液Ⅱ处理步骤,获得的总RNA效果较好:得率高,RNA产量可达74.7 μg(100 mg)-1;没有DNA污染,A260 nm/A280 nm/2.026,A260 nm/A230 nm值为2.082,说明蛋白质及其它污染非常低,通过RT-PCR成功地扩增出了麻疯树curcin基因长为927 bp的特异条带.相比林莎的方法,改良SDS酸酚法具有经济、简便、适用性广的特点.图5表1参13     

对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选及特性鉴定

为筛选对甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株,提取12株供试Bt菌株的晶体蛋白,溶解后加入到甘薯茎线虫悬浮液中,统计3 d和7 d后甘薯茎线虫的死亡率.经初筛和复筛后得到一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL.研究了YBT-008的生物学特性,结果表明,YBT-008在LB培养基上培养约12 h后进入稳定期,并且伴随芽胞的形成产生卵圆形的伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明YBT-008可产生多种待鉴定的晶体蛋白类型,质粒检测显示该菌株有5条质粒条带.YBT-008的获得为利用Bt防治甘薯茎线虫提供了新型菌株和基因资源.     

土壤宏蛋白质组学蛋白质提取方法及其应用

土壤宏蛋白质组学在揭示土壤微生物功能、代谢与环境相互作用方面具有广阔的应用前景,但由于土壤样品的特殊性,土壤蛋白质提取步骤是限制土壤宏蛋白质组学大规模应用的瓶颈之一.本文从样品制备、提取方法、影响因素等方面综述了土壤蛋白提取方面的研究进展.一般来说,根据实验目的、蛋白种类及后续研究方法设计相应的分组成收集策略才能取得较好的提取效果.土壤总蛋白、胞内蛋白与胞外蛋白分别有不同的提取方法.总蛋白提取一般采用直接提取法;胞外蛋白不需要裂解;胞内蛋白提取方法有直接提取法和间接提取法等.裂解、浓缩、去除腐殖质的方法以及提取液、pH值的选择等也会影响提取效果.此外,简单介绍了土壤宏蛋白质组学的应用,并对今后的研究工作提出展望.表1参36     

黄芪多糖的提取及按相对分子质量分段分离

黄芪多糖(APS)具有多种生物活性以及广泛的临床应用,然而目前对其研究大多以相对分子质量(Mr)范围分布较大的总多糖为对象,使得药理活性机制等研究难于深入.采用常温渗滤方法提取黄芪多糖,粗多糖得率为15.92%,多糖含量为82.43%,较传统水煮醇沉法有较大提高;对提取的粗多糖用离子交换层析进行纯化、用分步醇沉联合凝胶层析进行分段分离,获得7个多糖组分,经高效液相色谱(HPLC)测定,分离的7个组分皆为均一组分,高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测定证明该7个组分具有不同的Mr,其范围分布在1.4×103～157.7×103,为进一步研究黄芪多糖活性提供了良好的材料.     

高效菲降解菌降解特性与蛋白组学研究

研究了各种条件下高效菲降解菌ZXl6对菲的降解特性,并借助一维与二维蛋白质组学分析技术,比对了菲诱导前后ZXl6蛋白表达差异.结果表明,该菌株利用菲生长的最适温度为35℃,最适pH为7.5,可以耐受并降解2 500 mgL-1菲.不能利用邻苯二甲酸,但可利用水杨酸和邻苯二酚.菌株细胞蛋白SDS-PAGE结果显示,菌株在菲诱导12 h后,出现两条M这l9x103和27x103的新增蛋白条带,从二维电泳图谱的相应分子量位置上发现3个新增表达蛋白,质谱分析与牛物信息学检索结果表明,2个点分别为芳香族加氧酶小亚基,1个点为顺式氯苯二氢二醇脱氢酶.     

温敏核不育水稻双低-S单胞期花药蛋白质的固相双向电泳分析

对温敏感核不育水稻双低-S不同温度下的单胞期花药蛋白质进行固相双向电泳分离,经银染后,获得了清晰而稳定的图谱。以300ug左右的蛋白质进行电泳,分离开的蛋白点(多肽)可超过500个.在32℃温度下的花药蛋白点要比19℃温度下多,其中蛋白质点(MW14KD,pI5.4)在19℃可育条件时稳定出现。32℃不育条件时却缺失;而蛋白质点(pI7.6)和蛋白质点(pI7.8)非常明显的在不育条件下出现,而在可育条件下缺失。     

印楝素对亚洲玉米螟的生物活性及蛋白质合成的影响

室内生物测定表明,印楝素对玉米螟幼虫具有明显的毒杀作用和抑制生长发育的活性.浓度3×10-6 ~15×10-6印楝素处理幼虫,均出现活动性降低、化蛹延迟、蛹出现畸形的现象,甚至形成永久性幼虫,且与处理浓度有一定的相关性.同时发现,经印楝素处理后,亚洲玉米螟48h蛹蛋白质的含量和组分与对照相比出现明显的差异,含量与处理浓度有较好的相关性.SDS-PAGE结果显示, 经3×10-6 ~15×10-6印楝素处理,昆虫的蛹均出现分子量Mr55×103、50×103两种新蛋白组分,减少了21. 6×103、20×103两种蛋白组分;另外10×10-6和15×10-6印楝素处理还减少了22×103蛋白组分, 15×10-6处理还出现9×103新蛋白组分; 这6种差异蛋白可能是印楝素分子作用的相关蛋白. 图2表1参20     

甘薯块根腐烂真菌的分离和鉴定

从腐烂甘薯块根中分离到4株丝状真菌,分别编号为SP-1、SP-2、SP-3和SP-4,它们都能在甘薯块根片上快速生长.将这4株真菌接种在PDA培养基上,观察其菌落形态和结构特征.提取4株菌的总DNA,利用真菌的18S rDNA通用引物进行扩增、克隆和测序,其18S rDNA序列的长度分别为1 810 bp、1 769 bp、1 768 bp和1 770 bp.将这些序列在GenBank中进行序列比对,获得的同源性较高的序列用于构建系统进化树.根据分子鉴定和形态观察的结果,SP-1菌株是匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)SP-1,SP-2是尖镰孢(Fusarium oxysporum)SP-2,SP-3是康宁肉座菌(Hypocreakoningii)SP-3,SP-4是肉座菌属(Hypocrea),命名为Hypocrea sp.SP-4.     

生物絮凝丝状真菌Talaromyces sp.CC-1胞外多聚物的提取及组分分析

以一株高絮凝活性的丝状真菌菌株——糙刺篮状菌(Talaromyces sp.CC-1)为研究对象,考察了热提取法、离心沉淀法、阳离子交换树脂法、NaOH-超声法等4种方法对该菌株胞外多聚物(ECP)的提取效果,结合细胞破坏程度(核酸含量)、ECP的提取效率、化学组成分析对这4种方法进行评价.结果表明,Talaromyces sp.CC-1产生的ECP的化学组成以多糖为主,4种方法中多糖分别占ECP总量的中97%、73%、72%、67%.其中,热提取法既能提高ECP的提取效率(提取量为940 mg·L-1),又不会在提取过程中对菌株细胞造成破坏(核酸仅占ECP总量1%,为离心沉淀法、树脂法和NaOH-超声法的0.06、0.04、0.03倍),是较适宜的ECP提取方法.红外光谱(FI-IR)对热提取的ECP的进一步分析表明,ECP结构中含有较多的羧基、羟基、氨基等絮凝活性基团,凝胶渗透色谱(GPC)分析显示,ECP的分子量分布为1.7×105—3.4×106Da之间,高效液相色谱(HPLC)测定ECP的单糖组成,发现ECP中多糖主要由葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖等单糖构成(物质的量之比为95.7∶5.8∶1.8∶1).     

一株对鳞翅目害虫高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株基因型鉴定及新基因cry2Ah3克隆

HYW-8是本实验室自行分离的一株对鳞翅目害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌,PCR-RFLP鉴定含有cry1Ab、cry1E基因和一种新的cry2A基因,根据cry2A全长基因序列设计特异引物,获得全长基因.测序结果表明,该基因开放阅读框为1 896 bp,编码632个氨基酸,相对分子质量(Mr)是70.774×103,等电点pI=7.79,与已知的cry2Ah2基因编码的蛋白的同源性最高为98%.该基因序列已在GenBank中登记注册,登录号为GU073380,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry2Ah3.SDS-PAGE分析,HYW-8菌株表达130×103大小蛋白,未见70×103大小蛋白.     

从麻疯树胚乳中提取总RNA的快速方法

以麻疯树胚乳为材料,建立了一种适合于提取富含油脂、蛋白及多酚、多糖等次生物质的植物总RNA的方法.其中,提取液Ⅰ在1.5%SDS和400 mmol/L NaCl盐溶液条件下能快速有效破壁,酸酚/氯仿促进了细胞裂解以及油脂、蛋白的分离.而基于异硫氧酸胍法的提取液Ⅱ进一步强烈抑制Rnase的活性,确保RNA不被降解,并以5 mol/L高浓度NaCl溶液除去植物组织提取液中的多糖、多酚等次生物质,得到质量较好的总RNA样品.     

湿疹喷雾剂提取方法的研究

目的对湿疹喷雾剂提取方法进行优选,以保证制剂质量达到标准.方法选择渗漉法、回流法、浸渍法、超声法研究方中徐长卿、黄芩、紫草等六味药材的最优提取方法,并运用正交设计试验法优选工艺条件,采用高效液相色谱法测定方中丹皮酚、黄芩苷的含量,以此作为评价工艺的指标.结果回流法提取徐长卿、黄芩等五味药材最优工艺条件为:不浸泡,加醇量6倍、4倍,回流时间60、40 min,黄芩苷、丹皮酚浸出量分别可达401.86、97.93 mg,而渗漉法的最优工艺条件为:粉碎度20目,渗漉速度3 mL/min,浸渍时间24 h,加醇量为10倍,黄芩苷、丹皮酚浸出量分别可达332.04、92.27 mg.紫草单独用超声法提取,40 min时吸光值最大,为0.676;而用浸渍法则需36 h吸光值才达到最大,为0.492.结论徐长卿、黄芩等五味药材采用回流法较渗漉法提取效率高,紫草采用超声法较浸渍法提取效率高.表9,参5     

白地霉(lip42)脂肪酶的纯化及酶学性质

白地霉(Geotrichum candidum)经过发酵培养,以发酵液为lip42脂肪酶粗酶液,经硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DEAE纤维素柱层析及Sephadex-75凝胶柱层析纯化处理,脂肪酶比活力达到121.68U/mg,纯化倍数为粗酶液的7.3倍,回收率为30.25%,经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,相对分子质量约64×103.脂肪酶的酶学性质研究结果表明:在40℃以下温度保存1h内酶活性相对稳定;在pH8.0和30℃反应条件下表现相对高的酶活性;在Mg2+存在情况下酶活性提高10%左右,而其它离子如Cu2+、Zn2+等以及0.1%的Tween80、Tween20及Triton-100对酶活性却有不同程度的抑制作用,1mmol/L的SDS和EDTA-Na对酶活性的影响很微小.