假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.     

碱性果胶酯裂解酶工程菌的构建

从本研究室筛选的BacillussubtilisWSHB04-02菌株中扩增出编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因PL,将其插入大肠杆菌分泌表达载体pET22b( )多克隆位点,得到重组载体pET22b( )PL.序列分析表明,所获PL基因与已报道的B.subtilisSO113的PL基因的同源性为98%.重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达.SDS-PAGE分析显示,表达产物的分子量(Mr)均为43×103,同核酸序列测定所推导的值相符.该工程菌经IPTG诱导后,胞内酶活为8U/mL.研究发现,碱性果胶酯裂解酶不仅在胞内有酶活,胞外也有酶活,说明所构建的表达体系可使该酶向胞外分泌.图3表1参6     

铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究

根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因设计了上下游引物P1和P2,通过对铜绿假单胞菌菌株X3绿色荧光蛋白标记研究,构建了铜绿假单胞菌标记系统,获得带有EGFP标记的基因工程菌X9,为进行相关的跟踪研究创造了条件.该菌株绿色荧光标记性能稳定.通过转化子基因组DNAPCR和斑点杂交检测,外源EGFP基因存在于转化子染色体上. 图 6参 14     

豆豉纤溶酶在枯草杆菌WB800中的高水平表达

一个来源于豆豉产生菌DC12的新的纤溶酶基因序列被克隆测序.为了实现在枯草杆菌中高水平表达豆豉纤溶酶,将来源于枯草杆菌168的重叠启动子P43序列以及转录终止信号序列通过重叠延伸融合,将融合序列克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3中,构建了pBEP43载体.将豆豉纤溶酶基因插入到载体pBEP43后转化枯草杆菌WB800.结果表明,在P43启动子驱动下,豆豉纤溶酶基因在重组菌中的对数生长期和平衡期均获得了表达且分泌到培养基中.重组菌经培养后上清液中的纤溶酶活性最高达1270U/mL,是豆豉纤溶酶基因在自身启动子驱动下表达量的1.87倍和野生菌株枯草杆菌DC12表达量的4.1倍.图5参16     

绿萍LmPDS基因RNAi载体的构建及遗传转化

PDS基因编码控制类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶,其被沉默或抑制性表达会使叶片组织出现斑驳、黄化、白化的现象.构建绿萍(Lemna minor)LmPDS基因RNAi载体及完成遗传转化研究,对于实现RNAi技术在绿萍中的应用具有重要意义.选取595 bp LmPDS基因片段为干涉片段,利用中间载体pUCCRNAi将克隆的LmPDS干涉片段正反向插入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCST中.将成功构建的RNAi载体通过农杆菌介导法转入绿萍愈伤,经愈伤抗性筛选、植株再生、植株扩培、标记基因NPTII检测等过程,获得植株70株,其中4株为转基因阳性植株.再经荧光定量PCR分析、番茄红素含量检测、表型观察转基因植株.结果显示,转基因阳性植株LmPDS相对表达量明显下降,为对照的28.8%-40.5%,其番茄红素含量也明显下降,且叶片出现了明显的白化表型.本研究成功构建绿萍LmPDS基因RNAi载体,实现了RNAi在绿萍中的应用,结果可为进一步的绿萍基因功能研究提供材料和方法.(图11表1参30)     

拟南芥硫酯酶基因(atfata)在大肠杆菌中的表达及其对游离脂肪酸合成的影响

硫酯酶催化脂酰ACP(酰基载体蛋白)水解生成游离脂肪酸和ACP载体蛋白,能够解除脂肪酸合成与磷脂合成的偶联,是获得游离脂肪酸的关键基因.将拟南芥的硫酯酶基因atfata克隆到原核表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了His-tag融合蛋白,经SDS-PAGE检测获得特异性表达条带.对该重组菌株进行摇瓶发酵实验,GC-MS检测表明其与对照菌株脂肪酸组成并未发生变化;但其脂肪酸产量达到232.06 mg/L,比对照菌株提高了70%;同时胞外游离脂肪酸产量达到了33 mg/L,占总脂肪酸含量的15%,是野生菌株胞外脂肪酸产量的7倍.图3表2参17     

质粒pACYC184电转化松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5－1A

以质粒pACYC184为材料,研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌的最适电转化条件.结果表明,荧光假单胞菌GcM5-1A培养至D600nm为0.5时制备感受态细胞,以300 mmol/L蔗糖溶液为电击缓冲液,质粒DNA终浓度为0.01 ng/μL,在25 μF电容、9 kV/cm电场强度、200 Ω电阻的电击条件下电击一次,可得最大的电转化效率,即5.5×106/μg(DNA).SDS-PAGE分析显示,转化质粒pACYC184的氯霉素抗性基因在受体细胞内得到了表达.本方法的建立为松材线虫携带的荧光假单胞菌的基因导入提供技术支持.为进一步通过基因敲除的方法,选择性地失活特定功能基因,进而确定这些基因在松材线虫病病理进程中的作用奠定基础.图2参16     

过量表达沙冬青巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI提高大肠杆菌低温与热胁迫抗性

沙冬青是我国北方内蒙古荒漠地区特有的常绿阔叶灌木,具有很强的抗低温、干旱、盐碱能力,是重要的抗逆基因资源植物.将从低温诱导的沙冬青幼苗中克隆获得的巯基蛋白酶抑制剂基因AmPI亚克隆后构建到原核表达载体pTWIN1上,得到重组表达载体pT-PI,双酶切及测序结果证明pT-PI已经构建成功.将pT-PI转入大肠杆菌ER2566中,经异丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE电泳检测发现有Mr35×103的目的融合蛋白表达,与预测结果一致,其中以在37℃诱导3～4h条件下表达量最高,表明目的基因AmPI在大肠杆菌中得到了成功表达.分别测定了低温(0℃)和热胁迫(50℃)条件下AmPI宿主菌的生存能力,结果表明AmPI的表达能提高宿主菌的存活率,可能是AmPI对细胞具有保护功能.     

中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定

利用PCR方法,将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464)开放阅读框的3′末端截短99bp,插入到原核表达载体pET30a( )的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA.将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3),0.5mmol/LIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)28℃诱导重组鲨烯合酶的表达.表达产物经镍琼脂糖柱纯化.纯化蛋白加入酶促反应体系(含FPP和NADPH),GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物,结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化.青蒿鲨烯合酶的功能鉴定为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成,从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础.图5参15     

人α-防御素HNP-2基因在大肠杆菌中的表达

通过半化学合成方法获得具有大肠杆菌密码子偏爱性的人α-防御素(Human α-defensin或human neutrophil peptide,HNP)HNP-2基因.将其克隆到pET-32a( )表达载体,构建了重组表达质粒pET-32a( )/HNP-2.分别转化大肠杆菌BL21(DE3),ER2566以及Origami B(DE3)宿主菌,经过表达条件的优化,结果在大肠杆菌Origami B(DE3)宿主菌中得到了HNP-2基因高效率可溶性的表达,融合蛋白表达量占细菌总蛋白的60%以上.为避免表达产物水解,得到更稳定的人α-防御素,尝试以环化形式和酰胺化形式表达人α-防御素.为得到环化形式的表达,采用intein作为工具,利用其可剪接extein的特点,将其N端区域和C端区域分别融合到HNP-2的C端和N端,其两端的intein片段可将其拼接成环肽.以此为基础构建了环化表达质粒,并对表达条件进行了探索.本文采用了一种新的酰胺化方法,即将intein与HNP-2融合表达,intein对目的短肽进行酰胺化修饰.图6表1参16     

肺炎嗜衣原体主要外膜蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达与鉴定

表达肺炎嗜衣原体（Chlamydia pneumoniae,Cpn）主要外膜蛋白（MOMP）的可变区VD2-VD3区．纯化产物并进行免疫活性分析,为探索重组蛋白在肺炎嗜衣原体血清学诊断中的应用提供资料．应用聚合酶联反应（PCR）技术,从肺炎嗜衣原体标准株AR-39的MOMP上扩增出抗原优势表住VD2-VD3区,将目的片段定向插入pET-30a载体,转化大肠杆菌B121,IPTG诱导表达并以Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物并行western-blot鉴定．成功构建了pET-30a-MOMPVD2-VD3的原核表达系统,表达并纯化出相对分子质量（Mr）为24×10^3Da的重组蛋白．Western-blot证实重组蛋白能与Cpn MOMP多克隆抗体发生特异性反应．肺炎嗜衣原体的MOMPVD2-VD3基因可以在大肠杆菌中得到表达,其表达产物能与相应的抗体结合,为肺炎嗜衣原体诊断候选抗原的研究奠定了基础．图4,参9．     

海洋破囊壶菌△~5-延长酶和△~4-脱饱和酶在酿酒酵母中的共表达

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA C22:6n-3)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸.分别以质粒pYTFD5和pYFAD4为模板,扩增获得860 bp的△5-延长酶基因(elo5)和1 600 bp的△4-脱饱和酶基因(fad4).利用重叠延伸PCR构建elo5-fad4融合基因,Hind Ⅲ/Sph Ⅰ双酶切后连接到经同样处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYEL05-FAD4.转化酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株INVScl,通过缺少尿嘧啶的选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C20:5底物.半乳糖诱导表达.气相色谱-质谱分析表明,重组酵母总脂肪酸中出现了DHA(二十二碳六烯酸,C22:6n-63)新产物,融合基因elo5-fad4在酿酒酵母中得到了表达.图7表1参18     

纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定

利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得了纳豆激酶成熟肽基因(NK),从而构建了大肠杆菌表达质粒NK/pTWIN1,NK/PET32a及NK/PML-c2x,经分别转化宿主菌ER2566,BL21和ER2566,获得了转纳豆激酶基因重组菌.结果表明,NK/pTWIN1-ER2566和NK/PET32a-BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高.本研究选用NK/pTWIN1-ER2566作为表达菌株,对其进行发酵表达.SDS-PAGE显示,目的蛋白约占菌体总蛋白的36%,该蛋白是以包涵体形式存在的.包涵体经收集、蛋白变性及复性,并经过SP Sepharose分离纯化,得到了纯化的纳豆激酶蛋白,琼脂糖-纤维蛋白平板法测出1mg纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于600u尿激酶.本文从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为利用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础.图5表1参11     

木聚糖酶基因xynB在不同大肠杆菌表达系统中的表达比较

从黑曲霉(Aspergillus niger)nl-1中克隆获得木聚糖酶基因xynB.该基因全长745 bp,含有67 bp内含子,与公布的黑曲霉xynB基因有较高的同源性.将PCR扩增的木聚糖酶成熟肽基因和含有信号肽的基因分别连接到表达载体肠杆菌Top10 F’、DH10B和两种BL21宿主中获得重组菌株.通过IPTG诱导,xynB基因在重组菌株中获得特异性表达.表达产物以胞内可溶性蛋白和不溶性包涵体形式存在.诱导4 h,重组菌株pTrc-99a-xynB[BL21 condon plus(DE3)]表达量最高,胞内酶活达到299 IU/L.重组质粒pTrc-99a-xyn B(S)在不同宿主胞内和胞外均能分泌目的蛋白,诱导10 h,胞外酶活pTrc-99a-xynB(S)[BL21 condon plus(DE3)]达到347 IU/L.而pET-20b-xynB(S)在两种BL21宿主中均不表达.经SDS-PAGE分析,以pTrc-99a和pET-20b作为表达载体时,重组蛋白相对分子质量分别约为45×103和30×103.与pET-20b相比,pTrc-99a以及自身信号肽的引导更有利于重组木聚糖酶的表达.     

矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BSMTcDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBSMT1(GenBank No.AA0501)和phBSMT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在Gen-Bank登录号为DQ494491,命名为phBSMT3.构建的BSMT3 cDNA的原核表达质粒pGBSMT转化BL21(DE3)E.coli,获得的重组菌株经0.01mol/LIPTG诱导后得到正确表达的GST-BSMT融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BSMT在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24     

鼠Tcp11l1基因的结构与表达分析

为了分析鼠Tcp11l1基因的结构和表达,从小鼠睾丸组织总cDNA中扩增鼠Tcp11l1基因的开读框架(Open reading frame,ORF),定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建融合表达质粒pTcp11l1-EGFP,转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察Tcp11l1基因的亚细胞定位;设计跨小鼠Tcp11l1基因两个外显子的引物,RT-PCR分析此基因在小鼠各组织中的表达情况.并利用生物信息学的方法对鼠Tcp11l1基因的结构进行初步预测.转染pTcp11l1-EGFP后在胞质中能明显看到绿色荧光信号,而在胞核和胞膜中无绿色荧光信号,表明鼠Tcp11l1蛋白定位于细胞质;RT-PCR分析结果表明,鼠Tcp11l1基因在小鼠各组织中广泛表达.生物信息学结果表明,鼠Tcp11l1和鼠Tcp11的蛋白具有相同的TCP11结构域,不能确定是否存在跨膜序列.鼠Tcp11l1基因和鼠Tcp11基因具有相似的亚细胞定位和TCP11结构域,表明这两个基因可能具有相似的受体功能.但是与Tcp11特异表达于睾丸组织的延长精细胞和精子不同,Tcp11l1为广泛表达,说明Tcp11l1可能在多种组织细胞中发挥作用.     

邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物，以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板，扩增出邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O)基因，将该基因和表达载体pET—30a( )连接，转化E.coli JM109(DE3)，获得了高效表达的转化子，SDS—PAGE结果表明，转化子的C23O蛋白不仅在细胞内存在，而且能被分泌到胞外，薄层扫描显示，转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的42％，酶活分析表明，分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C23O比活力，Southern杂交将菌株ZL5的C23O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上。图5表1参12。     

黑曲霉耐热木聚糖酶XYNB在毕赤酵母中的高效表达

高比活木聚糖酶的高效表达是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低生产成本的有效途径.将黑曲霉木聚糖酶基因XynB(不含信号肽)克隆到分泌型表达载体pPIC9K上,线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,G418和PCR鉴定的阳性转化子经0.5%甲醇、在28℃诱导表达.SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为20×103左右.优化的诱导表达条件为,每隔12 h添加0.5%的甲醇,发酵5 d后,比活达4 757 U/mg;其最适温度为55℃,最适pH为5.0,80℃处理30min后仍有74%的残余酶活.     

重组人核糖核酸酶抑制因子基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定

人核糖核酸酶抑制因子(Human ribonuclease inhibitor, hRI)是细胞质中的一种酸性糖蛋白,可以与血管生长因子(Angiogenin, Ang)紧密结合从而抑制血管形成.利用全基因组合成法合成针对人核糖核酸酶抑制因子基因(hri)的发夹shRNA序列,亚克隆到siRNA表达载体pKD;重组载体经酶切鉴定后,用脂质体法与报告基因绿色荧光蛋白重组融合的人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri共转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测干扰效果.用Image-Pro plus 4.5软件对绿色荧光照片半定量分析干扰效率.结果表明,荧光显微镜显示B16中表达的绿色荧光被干扰,荧光强度半定量分析干扰效率可达80%以上.成功重组构建了针对hri的siRNA表达载体.图5参9     

离子液体[BMIm][PF6]增强抗性质粒RP4介导的接合转移基因mRNA的表达水平

环境中广泛存在的抗生素和抗生素抗性基因会导致很严重的人类健康风险。在我们前期研究中发现,离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])作为环境选择性压力可以促进抗生素抗性基因的水平转移。本研究以E.coli DH5α(RP4)和同属的E.coli HB101,以及E.coli DH5α(RP4)和跨属的Salmonella enterica之间的纯菌接合转移体系为考察对象,从mRNA基因表达调控水平角度阐明离子液体[BMIm][PF6](0.001~2.5 g·L-1)影响质粒RP4接合转移的机理。结果表明,离子液体[BMIm][PF6]通过抑制基因kor A,kor B和trb A的mRNA表达水平来提高接合和跨膜转运基因trb Bp和trf Ap的表达;增强水平转移基因tra F的mRNA表达水平,并通过增强负调控基因kil A和kil B的mRNA表达水平抑制质粒的垂直传递过程;通过抑制基因trb K的mRNA表达水平降低接合转移体系的排斥效果,从而促进质粒RP4的接合转移。该结果有助于为抗生素抗性基因在环境中水平转移扩散的机理研究提供理论依据。