苏云金芽胞杆菌生物活性成分研究进展

自1901年Ishimata从家蚕(Bambyx mori)中分离出第1株苏云金芽胞杆菌淬倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp.sotto)以来,对苏云金芽胞杆菌研究已有百年的历史.现在国际上确认的苏云金芽胞杆菌菌株已有69个血清型[6],近40000株. 由于苏云金芽胞杆菌的巨大经济利益,不断地引起了广大科研人员和产品开发商的极大兴趣.到目前为止,科学家们已     

苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究

利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.图5参12     

苏云金芽胞杆菌菌株WB9编码活性因子的基因分析

采用PCR—RFLP及PCR技术对苏云金芽胞杆菌新分离菌株WB9的ICP、VIP、几丁质酶和肠毒素4种活性因子的编码基因进行了分析．结果表明，该菌株含有编码ICP的cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和cry1GaS个cry1基因型，编码Vip3A蛋白的vip3A基因以及编码3种肠毒素的hblA、bceT和entS基因；不含编码几丁质酶的基因．将vip3A、hblA、bceT和entS基因PCR产物回收纯化后直接测序，经在线的BLAST软件进行同源性分析，前两个基因片段与Bt已公布基因序列的相应片段同源性分别为99％和96％～98％，bceT基因片段与蜡质芽孢杆菌bceT相应片段同源性为97％．     

苏云金芽胞杆菌聚γ-谷氨酸-明胶微胶囊剂制备及其抗逆性

晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的主要杀虫成分,其抗热处理能力及抗紫外照射能力差,造成在生产及使用过程中易失活,防效不稳定,残效期短.为改良Bt剂型,探讨了以聚γ-谷氨酸(γ-PGA)-明胶为囊壁材料的复凝聚相分离法制备Bt微胶囊剂的加工工艺,并对制得的Bt微胶囊剂进行了抗热及抗紫外能力分析,比较了Bt成囊前后的杀虫活性和芽胞存活率.结果表明,经紫外(30 w)照射4 h,Bt微胶囊和Bt原粉对棉铃虫3龄幼虫的相对致死率分别是53.57%和16.60%,芽胞存活率分别是46.63%和6.90%;于80℃处理100 min后,对棉铃虫3龄幼虫的相对致死率分别是43.42%和26.11%;于100℃处理15 min,Bt微胶囊和Bt原粉的芽胞存活率分别是72.53%和25.50%.Bt微胶囊化可显著提高Bt对热处理及紫外照射的抗逆性.图4表2参13     

利用 S-层蛋白CTC在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础.用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段,构建了2个融合基因ctc-pmga1.2p和csa-ctc-pmga1.2p(csa表csaAB操纵元,其与S-层蛋白牢固地锚定到细胞表面密切相关);将含融合基因的重组质粒电转化入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中,获得了2个重组菌株BCCG(含ctc-pmga1.2p和携带csaAB操纵元的质粒)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p).血凝和血凝抑制试验结果显示,2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组蛋白PMGA1.2P;小鼠免疫学实验证实,2个重组菌株所展示的重组蛋白均具有免疫原性,其中,重组菌株CG的免疫效果优于BCCG.结果表明,苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可被用来研制热稳定性禽用口服疫苗.     

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参 11     

对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选及特性鉴定

为筛选对甘薯茎线虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株,提取12株供试Bt菌株的晶体蛋白,溶解后加入到甘薯茎线虫悬浮液中,统计3 d和7 d后甘薯茎线虫的死亡率.经初筛和复筛后得到一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL.研究了YBT-008的生物学特性,结果表明,YBT-008在LB培养基上培养约12 h后进入稳定期,并且伴随芽胞的形成产生卵圆形的伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明YBT-008可产生多种待鉴定的晶体蛋白类型,质粒检测显示该菌株有5条质粒条带.YBT-008的获得为利用Bt防治甘薯茎线虫提供了新型菌株和基因资源.     

不同来源的苏云金芽孢杆菌aiiA基因表达及其抗病性分析

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)aiiA基因所编码的AiiA蛋白是一种内酯酶,可以降解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs),从而减弱致病菌产生的危害.本研究克隆了6株不同来源的苏云金芽孢杆菌aiiA基因,并对来自于苔藓(LLB15)和土壤(LLS9)的BtaiiA基因进行了生物信息学分析.结果表明,AiiA-B15分子量为27.97×103,等电点为4.59;AiiA-S9分子量为28.14×103,等电点为4.32,两者都是亲水性蛋白.AiiA蛋白具有很高的保守性,AiiA-B15和AiiA-S9同源性为90%.进化树结果表明,AiiA-B15与Bacillus thuringiensis subsp.kyushuensis进化距离最近,AiiA-S9与Bacillus cereus进化距离最近.将aiiA-B15基因克隆到pGEX-4T-3表达载体中,构建重组质粒pGEXaiiA-B15,IPTG诱导后可大量表达融合蛋白.对表达的条件进行优化.结果表明,0.6mmol/LIPTG,30℃下诱导3h为最佳诱导条件.致病性检测表明,该融合蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌具有较强的抗病作用.图13表4参23     

胶质类芽胞杆菌对花生生长和土壤微生物学性状的影响

研究不同施用条件下胶质类芽胞杆菌3016对花生生长、土壤酶活性及微生物多样性等的影响,为揭示该菌种的增产机理提供依据.田间小区试验设置4个处理:T1(对照)、T2(接种3016)、T3(接种3016,50%的常规施肥量)和T4(常规施肥).结果发现,T3处理花生单株总果数、单株总果重、百仁重、出米率和产量表现均为最高,分别高出对照27.1%、22.9%、7.8%、2.4%和10.4%;花生果仁和茎叶中养分含量与T4处理持平或略高,其中钾含量增加显著(P0.05),分别达到0.55%和1.19%;同时,T3处理土壤细菌、放线菌数量和土壤脲酶活性也显著(P0.05)高于对照,土壤菌群结构得以改善,有助于实现土壤肥力的提高.因此,接种胶质类芽胞杆菌3016配施50%的常规施肥量,不仅能达到花生高产的目的,而且改善了土壤的生物学性状,是一种节本增效的施肥方式.     

两种启动子对聚γ-谷氨酸降解酶基因在地衣芽胞杆菌中的加强表达效果

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.比较了蔗糖诱导的枯草芽胞杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)启动子和地衣芽胞杆菌α-淀粉酶基因启动子对γ-PGA降解酶基因ywtD在地衣芽胞杆菌中加强表达的影响.分别用SacB基因启动子和α-淀粉酶启动子构建了穿梭表达载体pHY300-SYT和pHY300-PYT,通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组子SYT和PYT.酶活测定结果显示SYT和PYT中γ-PGA降解酶基因ywtD得到加强表达,摇瓶发酵结果显示两个重组菌株的γ-PGA相对分子质量都由1 000 000~1 200 000降低为800 000~900 000,PYT的γ-PGA产量较对照菌株PLK提高了33%,由13.50 g L-1提高到17.97 g L-1,而SYT的γ-PGA产量则降低为10.85 g L-1.因此,α-淀粉酶启动子更适合于在地衣芽胞杆菌WX-02菌株中表达γ-PGA降解酶基因,从而获得高产低分子量γ-PGA的工程菌.     

苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学

利用高效克隆PCR产物的专用载体pMD18T,直接从苏云金芽孢杆菌WB9的PCR产物中克隆了cry1Ab17新基因.测序结果表明,该基因(GenBank登录号为AY646166)由3471个碱基组成,其编码的蛋白质含有1156个氨基酸残基,其中亲水性氨基酸占30.8%,疏水性氨基酸占45.2%,酸性氨基酸占12.9%,碱性氨基酸占11.1%.氨基酸序列的同源性分析结果表明,Cry1Ab17蛋白与已报道的Cry1Ab蛋白同源性为95.4%～99.7%,该蛋白的4个氨基酸残基———Pro170、Gly449、Gly796和Gly863与其它已报道Cry1Ab蛋白相应位置的氨基酸残基均不同.在核苷酸序列和氨基酸序列多重比较的基础上,应用PAUP4.0构建了Cry1A蛋白家族的系统发育树.SignalP分析结果显示,Cry1Ab17蛋白中不含信号肽序列.此外,对Cry1Ab17蛋白的二级结构和3个结构域也进行了预测和分析.图4表2参15     

生物硫铁生成菌的选育及其在重金属废水处理中的应用

为开发高效经济、环境友好的重金属废水处理技术,采用亨盖特(Hungate)厌氧技术分离出一株产生物硫铁复合材料的硫酸盐还原菌(Sulfate reducing bacteria,SRB),命名为SRB2,并对该菌株进行了生理特性、培养工艺和废水处理研究.菌体杆状稍有弯曲,革兰氏阴性菌,最佳碳源为乳酸钠.pH范围5.0～9.0,最适pH 7.0,最适温度为35℃,培养3 d生物硫铁量和硫化物含量能达最大值,分别为2.85 g L-1、358.048 mg L-1.正交试验结果表明,乳酸钠9.0 g L-1+组合氮源1.5 g L-1+硫酸亚铁10.0 g L-1时生物硫铁产量最高.16S rDNA序列分析表明,菌株与脱硫弧菌属Desulfovibriodesulfuricans strain 734同源性为99%.采用生物硫铁处理重金属Cu2+、Pb2+、Cd2+废水,结果表明生物硫铁能快速处理含Cu2+、Pb2+、Cd2+废水,2 min去除率达99.8%以上.因此,生物硫铁在各类重金属废水处理与重金属废水污染事故应急处理中具有较好的应用前景.     

斜带石斑鱼alpha型与rho型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究II相去毒酶谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)等海水鱼类机体内代谢去毒过程中的作用及机制,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到斜带石斑鱼肝脏alpha-GST(GSTA)、rho-GST(GSTR)基因cDNA全序列.序列分析结果表明,斜带石斑鱼肝脏GSTA基因cDNA全长1008bp,编码223个氨基酸;GSTR基因cDNA全长1002bp,编码225个氨基酸.构建系统进化树发现,斜带石斑鱼与鲤鱼、斑马鱼GSTA氨基酸同源性较高,而GSTR为鱼类所特有并共同占据进化树上独立的分枝,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物GST现有所有类型同源性均较低.     

基于主成分分析和水质标识指数的天津地区主要河流水质评价

于2009年5月(枯水期)、8月(丰水期)、11月(平水期)对天津地区蓟运河、潮白新河、永定新河、金钟河、北塘排污河、黑猪河、海河、大沽排污河、独流减河、青静黄排水渠、子牙新河和北排水河12条主要河流的水质进行监测,并对监测数据进行主成分分析,构建水质评价指标体系,采用水质标识指数进行水质评价。结果表明,主成分分析与水质标识指数相结合的评价方法客观可靠。从时间分布来看,枯水期水质最差,58.3%的河流为劣Ⅴ类水质,部分河流已经黑臭,8月水质较好。从综合水质标识指数来看,海河以南河流污染较为严重。该地区河流NH3-N污染最为严重,其次是BOD5、CODMn和TP,属于有机型及富营养化污染。