冷应激对断乳仔猪ACTH及皮质醇的影响

断乳仔猪在-3~3℃低温条件下冷暴露24h,然后在15~18℃室温条件下恢复,检测血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇的动态变化.结果表明,仔猪血浆中ACTH和皮质醇含量随冷暴露时间延长而逐渐升高,冷应激6h时,ACTH含量高于冷应激前的水平(P<0.05);冷应激12h时,ACTH和皮质醇含量与冷应激前比较均有极显著升高(P<0.01);冷应激24h时,两激素含量与冷应激前无显著差异.终止冷暴露后0.5h,ACTH和皮质醇含量均高于冷应激前水平(P<0.05,P<0.01);3h时两激素水平基本恢复正常,但6h时两激素水平再次升高(P<0.01),呈波动性变化.表1参10     

不同强度冷应激对大鼠肌肉、脾脏和肝脏中HSP70表达的影响

通过两个低温温度段对健康Wistar大鼠进行冷应激试验,利用免疫印迹技术检验肌肉、脾脏和肝脏中HSP70表达的相对变化情况,探讨不同时间和强度冷应激条件下,3种组织中HSP70表达的情况以及通过HSP70表达量的变化看是否可以将其作为评估冷应激的指标.正常饲养的大鼠环境温度为(20±1)℃,而实验组大鼠分别在(0±1)℃和(10±1)℃环境下进行低温冷应激,然后在冷应激后不同时间宰杀取组织,利用Western-blotting检测HSP70的表达量.结果表明:(1)在(0±1)℃急性冷应激条件下,随着冷应激时间的延长,肌肉和脾脏中HSP70的表达持续增加,与对照组(CK)相比,差异显著(P<0.05);(2)在(10±1)℃慢性冷应激条件下,仅1wk肌肉组中HSP70的表达增加(P<0.05),其它情况下各组织中HSP70的表达与CK相比无显著差异(P>0.05).上述结果说明,相应强度的冷应激可以诱导机体的HSP70表达,并且随时间延长,HSP70的表达增加,可以考虑将HSP70作为监测大鼠应激的指标.图1表2参14     

急性冷暴露对仔猪血浆中IL-2、IL-6、ACTH和皮质醇水平的影响

为了探讨急性冷应激对仔猪免疫系统的影响,本试验将18头45 d"约克夏"仔猪随机分成常温对照组(Control,C)、冷暴露组(Cold exposure,CE)和冷暴露并阻断糖皮质激素受体组(Cold exposure+RU486,CER).常温组在18～20 ℃、冷暴露各组在4～8℃环境下分栏饲养.冷暴露时间持续12 h,在冷暴露开始后的第0、1、3、6、9、12 h六个时间点对18头仔猪采血并分离血浆,分别使用双抗体夹心ELISA法检测各血浆样品的IL-2和IL-6水平,放射免疫分析法测定血浆样品的ACTH和皮质醇水平.结果显示:单纯冷暴露组IL-2水平和IL-6水平在冷暴露6 h时明显升高(P<0.01),ACTH水平在各时间点均明显降低(P<0.01),而Cortisol水平仅在冷暴露3 h时明显升高(P<0.01),IL-2与IL-6的水平呈强相关(r=0.959 5),ACTH与IL-2的水平呈巾等强度负相关(r=-0.435 9)、与IL-6的水平呈弱的负相关,皮质醇与IL-2的水平呈弱的负相关、与IL-6的水平呈中等强度负相关(r=-0.447 8);受体阻断组IL-2在冷暴露6h、9 h和12 h时均明显升高(P<0.01),IL-6在冷暴露6 h明显升高(P<0.01),ACTH在冷暴露各时间点均明显降低(P<0.01),IL-2和IL-6水平呈中等相关(r=0.416 1),ACTH与IL-2、IL-6的水平均呈强负相关(r=-0.676 5/-0.717 4),皮质醇与IL-2、IL-6均呈弱负相关.上述结果表明,急性冷暴露能使IL-2、IL-6及皮质醇的分泌增强,且阻断糖皮质激素受体会导致IL-2和IL-6之间以及ACTH与IL-2/IL-6之间的相关性改变.图1参21     

不同强度冷刺激对大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中CIRP表达的影响

采用Western blot和实时荧光定量RT-PCR方法,研究不同强度不同时间冷刺激后大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的表达情况.结果表明:常温(20℃±1℃)下大鼠4种组织中均存在一定的CIRP的表达;急性冷刺激组(-10℃±1℃、-4℃±1℃、0℃±1℃、4℃±1℃)心脏、大脑和睾丸中CIRP mRNA表达在冷刺激0～6 h呈上升趋势,6 h时达到最高值,随后呈下降趋势,肺脏中CIRP mRNA表达在0～6 h呈下降趋势,在6 h时达到最低值,随后呈上升趋势;慢性冷应激组(10℃±1℃)大鼠心脏、大脑和睾丸3种组织中CIRP mRNA在不同时间点(1周、2周、3 W周)的表达均高于正常对照组(P>0.05),肺脏CIRP mRNA表达均低于对照组(P>0.05),并且同一组织不同时间点之间差异不显著(P>0.05).可见冷刺激后CIRP的表达存在一定规律并且表现出组织特异性,可能与组织保护特异性有关.     

冷应激对仔猪血浆相关细胞因子和IgG水平的影响

将18头45日龄'约克夏'仔猪随机分成常温对照组(Control,C)、冷暴露组(Cold stress,CS)和冷暴露并糖皮质激素受体阻断组(Cold stress+RU486,CSRU).C组和冷暴露两组分别在18～20℃和4～8℃环境下饲养.在试验第0h、1h、3h、6h、9h、12h时对3组猪前腔静脉采血并分离血浆,应用双抗体夹心ELISA法检测各血浆样品IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IgG的浓度.结果显示,冷暴露时间对血浆相关细胞因子和IgG浓度都有不同程度的影响,而CSRU组与CS组对上述指标的影响有明显差异.冷暴露两组血浆IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ都呈先升高然后逐渐波动性下降的趋势,但是CSRU组升高的速度快于CS组;IgG、TNF-α呈先下降然后上升的趋势,但是CSRU组并未像CS组呈现显著的变化.结果提示各细胞因子间存在相互影响、相互倚赖的作用,构成了一个庞大而复杂的细胞因子网络,能迅速引起免疫应答,而糖皮质激素在机体的免疫系统中起着不可忽视的作用.     

亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹幼体相关免疫指标和应激蛋白(HSP70)表达的影响

为探讨亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹机体免疫力的影响,以及机体在胁迫过程中的应对策略,分别测定了幼蟹(平均体重3.25 g)在10、20、30、40 mg L-1亚硝酸盐暴露组和对照组中血细胞总数(Total hemocyte counts,THC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活力、丙二醛(Malodiadehyde,MDA)含量以及热休克蛋白70(Heatstress protein 70,HSP70)表达量在受胁迫2 d内的动态变化.结果表明:1)低浓度亚硝酸盐(10 mg L-1)胁迫组THC在胁迫3 h时显著高于对照组,肝胰腺中SOD活性在胁迫3 h和6 h时亦显著提高,表现出一定的"毒物兴奋效应".2)但随着暴露时间的延长和亚硝酸盐浓度的升高,幼蟹THC减少,肝胰腺SOD活性下降,而MDA含量升高.3)对照组中有少量的HSP70表达.幼蟹经10、20 mg L-1亚硝酸盐处理后,鳃组织中HSP70表达量在胁迫6 h后达到最大,而经30、40 mg L-1亚硝酸盐处理后,HSP70表达量在胁迫3 h后达到最大.各浓度组所诱导的HSP70最大表达量与水中亚硝酸盐的浓度呈正相关.以上结果说明亚硝酸盐胁迫可通过加剧组织中脂质过氧化的方式导致机体免疫力下降,肝胰腺中MDA的含量变化可作为亚硝酸盐胁迫的有效评价指标之一,而HSP70表达量的变化可作为早期预警指标应用于亚硝酸盐胁迫评价中.图2表1参36     

近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)热休克蛋白70对壬基酚的响应

以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术,检测不同时间(12、24、48、96和192h)不同浓度(0.01、0.1、1、10、100、300μg·L-1)壬基酚(NP)处理下近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)鳃、外套膜和消化腺中HSC70和HSP70基因mRNA的表达水平。结果显示,0.01μg·L-1NP能诱导近江牡蛎鳃和消化腺中HSC70和HSP70基因显著高表达(P0.05)。随着NP处理浓度的升高,其表达水平逐渐升高,处理一定时间后100μg·L-1NP诱导近江牡蛎HSC70和HSP70基因表达量显著高于300μg·L-1NP诱导表达量(P0.05)。HSC70基因在鳃和消化腺中显著高表达峰值出现在96 h时,在外套膜中出现在48 h时;HSP70基因在鳃中显著高表达峰值出现在48 h时,在外套膜和消化腺中出现在24 h时。可见,近江牡蛎HSC70和HSP70基因对NP具有显著反应性。     

急性低氧下白介素-6和低氧诱导因子-1α在大鼠海马中的表达

模拟5km急性低氧2h、4h、8h和24h,观察大鼠海马白介素6(IL6)和低氧诱导因子1(HIF1α)表达的时序变化.分别运用免疫组化和RTPCR分析海马CA1、CA2和CA3区IL6、HIF1α和海马HIF1αmRNA的表达水平.与对照组相比,5km急性低氧8h和24h,海马CA1区IL6水平升高14.24%(P<0.01)和7.76%(P<0.05);低氧8h,海马CA2和CA3区IL6水平上升3.1%(P<0.05)和5.1%(P<0.05).5km低氧4h、8h和24h,海马CA1区HIF1α水平分别升高3.67%(P<0.05)、5.5%(P<0.05)和6.27%(P<0.01),同时发现HIF1αmRNA在海马的表达上调.上述结果表明,5km急性低氧促进海马IL6和HIF1α的表达增强,推测HIF1α可能作为调控因子参与低氧下海马IL6的诱导表达.图5表1参21     

淡水双壳类背角无齿蚌AwHSP70基因克隆及多溴联苯醚-47对其表达的影响

热休克蛋白(HSP)参与蛋白质折叠、细胞膜转位和错误折叠蛋白质降解等过程,提高动物对环境的应激能力和适应能力。前期研究表明,多溴联苯醚-47(PBDE-47)对背角无齿蚌具有显著的氧化应激和急性毒性效应,为探讨PBDE-47慢性毒性效应;将背角无齿蚌随机分为对照组和PBDE-47处理组,处理组用3.36μg·L~(-1)浓度的PBDE-47进行处理,对照组用相同体积的二甲亚砜进行处理;克隆出AwHSP70基因,分析PBDE-47对AwHSP70表达的影响。结果显示,AwHSP70具有HSP70家族的标签序列,广泛分布于斧足、鳃、肝胰脏、闭壳肌、心脏、血淋巴和外套膜。PBDE-47处理可导致肝胰脏、鳃和血细胞中AwHSP70 mRNA水平显著升高。与对照组相比,PBDE-47处理组肝胰脏中AwHSP70 mRNA水平在1～15 d内增加2. 79倍(P<0.01)以上;鳃中AwHSP70 mRNA水平增加3.06倍(P<0.01)以上;血淋巴中AwHSP70表达增加1.81倍(P<0.05)以上。背角无齿蚌上调AwHSP70表达有助于增强动物对PBDE-47的耐受能力。     

低浓度五氯酚暴露对稀有鮈鲫体内SOD活性、GSH和HSP70含量的影响

为筛选检测低浓度五氯酚(PCP)对水生生物毒性效应较敏感的指标,将稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)暴露于浓度分别为0.5、1.5、5.0、15和50μg·L-1的PCP中2、7、14、21d,同时设乙醇对照组,检测稀有鮈鲫体内(整体匀浆)超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)、热激蛋白70(HSP70)含量等生化指标.结果表明,相同暴露时间下,随着PCP暴露浓度的升高,SOD活性均表现为先抑制后激活趋势,GSH和HSP70含量无明显变化;相同暴露浓度下,随着PCP暴露时间的延长,SOD活性均表现为先激活后抑制趋势,GSH和HSP70含量无明显变化.初步认定相对于GSH、HSP70含量,SOD活性的变化可以更有效地反映低浓度PCP对稀有鮈鲫的毒性效应.