盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶不同结构域蛋白的表达纯化及其抗体的制备与分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质.3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐生杜氏藻甘油合成途径中的关键酶.与已经报道的其它物种的GPDH基因不同,盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶(Ds.GPDH)基因具有两个独立的功能结构域,即丝氨酸磷酸化酶结构域(SGPP domain)和3-磷酸甘油脱氢酶结构域(GPD domain).本实验在已克隆的Ds.GPDH2基因的基础上,以含GPDH2全基因序列的T质粒载体(pMD18-T-GPDH2)为模板,PCR扩增分别得到两个单结构域片段(SGPP与GPD),以及双结构域片段(GPDH),构建了pET32a-SGPP、pET32a-GPD和pET32a-GPDH三种原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达.纯化蛋白制备抗原,制备出3个多克隆抗体.Western Blot和交叉反应分析显示通过重组蛋白制备的多克隆抗体具有很高的特异性.图7参16     

超声波对杜氏盐藻生长的刺激效应研究

以杜氏盐藻（Dunaliella salina）为实验材料,用超声波细胞均质仪作为超声装置对杜氏盐藻进行处理,分别设64 s和128 s两个时间强度处理,各时间强度均分16次、8次、4次、2次和1次五种间隔,以无超声波作用为对照。超声波作用解除后,将各处理在相同的培养条件下培养7 d,测定生长过程的吸光值、叶绿素a含量、最大光能转化效率、实际光能转化效和光合电子传递效率等指标。结果表明,在64 s和128 s两个总时间强度处理下,超声波短时间多次处理有利于杜氏盐藻的生长,使其吸光值、叶绿素a含量、最大光能转化效率、实际光能转化效率以及光合电子传递效率等指标均比对照有所提高。     

人载脂蛋白A5基因的克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备

人载脂蛋白A5(ApoA5)是血浆三酰甘油水平的重要决定因素之一,与心血管疾病密切相关,因此获得高纯度的载脂蛋白A5及其抗体具有重要的意义.本文利用PCR技术,从人肝癌细胞系7721的cDNA中扩增出ApoA5基因,并克隆到pThioHisD载体中导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达.经优化条件,发酵得到高效表达的融合蛋白,利用融合蛋白上的一段组氨酸序列,用镍离子亲和柱进行纯化,得到纯度大于95%的融合蛋白.使用纯化蛋白免疫新西兰大耳兔,得到多克隆抗体,Western印迹结果显示此多克隆抗体能与ApoA5特异性结合.图6参28     

雨生红球藻3个株系的生长及对光盐反应初探

对雨生红球藻3个株系（No.3、No.712和No.797)的生长、对诱导虾青素形成的光盐因子的反应进行了比较,结果表明：No.3、No.712和No.797的生长速率分别为0．128d^-1,0.137d^-1和0.144d^-1;外加盐的量较大（4gL^-1)时导致雨生红球藻细胞数的减少,而外加盐浓度较低（2gL^-1)时,细胞数的反应因株系和光照的不同而有所差异;盐和强光照均导致静细胞比例显著增加;盐的加入仅在弱光照下诱导雨生红球藻3个株系的虾青素累积,在强光照下却导致件株系虾青素含量的下降,强光照下不外加盐时No.3、NO.712和No.797藻液的虾青素含量无显著差异,分别为2.15、2.77和2．45mg L^-1。图1表2参12     

盐生杜氏藻烯醇酶基因启动子的克隆分析及胁迫转录应答

为了解盐生杜氏藻(Dunaliella salina)烯醇酶(Enolase)在渗透耐受中的具体功能,利用基因组步行方法和巢式PCR,从D.salina中克隆了烯醇酶基因DsENO 5’上游约2 000 bp的调控序列,并对其进行序列分析.分析表明,它包含多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box,TATA-box),富含光﹑干旱及其它胁迫应答元件.利用实时荧光定量PCR的方法,研究了高渗﹑高温以及低温外界胁迫条件下DsENO的转录情况,发现其受高渗强烈抑制,高温显著诱导而低温微弱诱导.     

非生物胁迫对盐生杜氏藻DsMPK转录、翻译和磷酸化修饰的影响

促有丝分裂活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK或MPK)途径是在真核生物中广泛存在的调控多种生理过程的信号途径,在细胞增殖、分化、凋亡、生物和非生物胁迫等生理过程的调控中起着关键的作用.盐生杜氏藻(Dunaliella salina,盐藻)是目前世界上最耐盐的真核光合生物之一.在前期实验中,已发现盐藻MAPK(DsMPK)的表达受到低温和高盐胁迫的抑制.分析DsMPK在高温、低盐、氧化、紫外胁迫中的表达变化,发现DsMPK还受到氧化胁迫的抑制.进而分析DsMPK在高温、低盐、氧化、低温、高盐和紫外胁迫中翻译和磷酸化修饰的变化,发现除低盐胁迫外,在磷酸化修饰水平DsMPK同样受到各种非生物胁迫的抑制.在对不同生长阶段盐藻DsMPK磷酸化变化的分析中还发现,DsMPK的磷酸化水平与生长速率有一致性.各方面DsMPK的变化趋势说明其为一调控生长相关的MAPK.     

盐藻烯醇酶基因表达载体的构建及其转基因烟草的鉴定

以载体pCAMBIA2301为骨架引入pBI121中的GUS基因，构建了简便、实用的中间载体pCAMBIA2301G．将其中一个GUS基因用目的片段盐藻烯醇酶基因替换，构建了可以在植物中高效表达的载体pCAMBIA2301G—enolase，并将其转入根癌农杆菌EHA105中，采用叶盘转化法将盐藻烯醇酶基因转入模式植物烟草中．Southern杂交结果显示，盐藻烯醇酶基因已整合到植物基因组中，在转基因烟草中的拷贝数为2～4个．图6参10     

盐胁迫下Dslhcb3和cao基因的表达及类囊体磷酸化状态转化

LHCⅡ在在类囊体膜中除了进行光能的吸收和传递之外,在维持类囊体膜的结构,调节激发光能在两个光系统之间的分配,光保护以及对各种环境的适应等过程中都起着重要的作用.为揭示盐藻LHCB在盐胁迫下的作用机制,以盐生杜氏藻(Dunaliella salina为材料,应用实时PCR的方法和蛋白电泳技术,研究lhcb3和叶绿素a加氧酶cao基因在低盐胁迫下的表达变化,以及盐藻类囊体膜的磷酸化水平和磷酯酶的变化.结果表明,在低盐环境下,lhcb3和cao基因的表达活性都呈降低的总趋势,这可能是盐藻适应不浓度盐环境胁迫的不反应.类囊体膜蛋白磷酸化水平先是降低,之后有所升高.时,发现磷酸酯酶有着相的变化趋势,并在12 h时最高.由此认为低盐条件下,类囊体膜蛋白在前期磷酸化水平的降低与磷酸酯酶活性降低有关,但在12 h后磷酸化水平有所升高,可能是细胞内平衡调节的结果,即磷酸激酶活性增强的结果.     

水稻精细胞差异表达基因RSG6的克隆和抗体制备

选用在水稻精细胞和二细胞花粉的差减文库中获得的在精细胞中表达量显著增强且可能代表新基因的EST之一 (BF4 75 2 0 7)为探针 ,筛选水稻精细胞cDNA文库 ,得到一全长为 1176bp的序列 ,其开放读码框编码 2 81个氨基酸 ,与已知蛋白质无明显同源性 ,属于一新发现的基因 ,GenBank登录号为AF4 4 2 4 90 .这是第 1次从高等植物精细胞中分离到的全长基因 .RT PCR结果证明该基因在根、叶、二细胞花粉、成熟花粉、授粉子房和精细胞中均有表达 ,但在精细胞中的表达量要高得多 ,是精细胞差异表达基因 .将此基因命名为RSG6 (ricespermgene6 ) .将RSG6的编码区克隆到表达载体pQE30上 ,构建重组质粒 .经IPTG诱导后 ,在E .coliM15 (pREP4 )中表达出了N端融合了 6×His的融合蛋白 .用纯化的融合蛋白免疫家兔 ,制得高效价、高特异性的抗体     

苜蓿根瘤菌乙酰-CoA合成酶的过量表达、纯化及特性

PCR扩增了苜蓿根瘤菌乙酰辅酶A合成酶编码基因 (acsA1) ,克隆到连接 -非依赖型载体pET30LIC ;在E .coliBL2 1(DE3)pLysS中得到了有效表达 ,表达需IPTG的诱导 ,诱导 3h达到酶活高峰 .采用His·Bind柱层析对ACS进行了纯化 ,纯化的酶蛋白经SDS-PAGE呈单一浓带 ,分子量约 72 0 0 0 ,具较高的酶活 ,是无细胞提取液的 12 .7倍 .酶动力学分析显示 ,Vmax、Km分别为 (4 13.6± 11.7)mmolL-1和 (5 .8± 0 .6 )mmolL-1.图 4表 2参 8     

重组BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白CIRP多克隆抗体的制备与鉴定

冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是第一种在哺乳动物细胞中被发现的冷休克蛋白,伴随着细胞冷应激过程过量表达.为进一步研究冷诱导RNA结合蛋白CIRP的生物学功能,构建重组BALB/C鼠CIRP的原核表达载体,重组BALB/C鼠CIRP蛋白经NI-NTA亲和树脂纯化后免疫獭兔制备抗CIRP多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot检测抗体效价和抗原特异性.本实验成功构建了CIRP的原核表达载体,在E coli XL-1-blue得到了高效表达,利用原核表达包涵体蛋白免疫獭兔获得了高效价的CIRP多克隆抗体,该抗体能识别肝脏和睾丸中天然的CIRP蛋白.图5参14     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定

利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得了纳豆激酶成熟肽基因(NK),从而构建了大肠杆菌表达质粒NK/pTWIN1,NK/PET32a及NK/PML-c2x,经分别转化宿主菌ER2566,BL21和ER2566,获得了转纳豆激酶基因重组菌.结果表明,NK/pTWIN1-ER2566和NK/PET32a-BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高.本研究选用NK/pTWIN1-ER2566作为表达菌株,对其进行发酵表达.SDS-PAGE显示,目的蛋白约占菌体总蛋白的36%,该蛋白是以包涵体形式存在的.包涵体经收集、蛋白变性及复性,并经过SP Sepharose分离纯化,得到了纯化的纳豆激酶蛋白,琼脂糖-纤维蛋白平板法测出1mg纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于600u尿激酶.本文从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为利用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础.图5表1参11     

诺氟沙星对海月水母螅状体Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因表达的影响

诺氟沙星(norfloxacin,NFLX)广泛应用于水产养殖中的鱼类细菌性疾病治疗。为探讨诺氟沙星对海洋生物的毒性作用,选择海月水母螅状体为受试生物,考察了不同浓度诺氟沙星和不同暴露时间对GTP结合蛋白(GTP binding protein)、氧化应激蛋白(oxidative stress protein)和热休克70 k Da蛋白(heat shock 70 k Da protein,Hsp70)表达量的影响。结果表明,NFLX对海月水母螅状体的48 h的半致死浓度(48 h-LC_(50))是415.1 mg·L~(-1),NFLX对海月水母螅状体的毒性属于低毒。随着NFLX浓度的升高和培养时间的延长,Hsp70基因在第7天浓度300 mg·L~(-1)时表达量受到显著性诱导(P0.05),较对照组升高9.1倍;GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因的表达量都呈现先急剧升高后降低的趋势。2个基因均在第1天受到显著性诱导(P0.05),分别在NFLX浓度100 mg·L~(-1)和300 mg·L~(-1)时表达量达到最大值,较对照组升高10.15倍和50.5倍。Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因在实验期间都对NFLX表现出较好的响应。     

External and internal carbonic anhydrases in Dunaliella species

Four species of Dunaliella and a carbonic anhydrase deficient mutant of Dunaliella tertiolecta (Butcher), HL 25/8, developed a process for concentrating dissolved inorganic carbon when adapted on air or low CO₂ for 24 h in the light. However, the external carbonic anhydrase activities in Dunaliella species were nil or low compared with those in Chlamydomonas reinhardtii (Danegard) or some Chlorella species. D. tertiolecta had low and about equal levels of external and internal carbonic anhydrase. D. parva (Lerche) and the D. tertiolecta mutant had negligible external carbonic anhydrase. D. viridis (Teodoresco) and D. salina (Teodoresco), high salt tolerant species, had high activities of intenal carbonic anhydrase but low levels of external carbonic anhydrase. Antiserum prepared against the 37 kDa peptide of extracellular carbonic anhydrase from Chlamydomonas reinhardtii was immunoreactive with a polypeptide of 30 kDa in D. tertiolecta and its salt sensitive external carbonic anhydrase (CA) mutant HL 25/8. External CA activity from D. tertiolecta was stimulated about three-fold, by including 0.5 M NaCl in the assay medium, while internal CA was not significantly affected by NaCl. External CA activities in the other species were insensitive to NaCl, while their internal activities were 90% inhibited by 0.5 M NaCl. Sorbitol only partly replaced NaCl in stimulating the external CA from D. tertiolecta. These experiments were performed with Dunaliella spp. grown in controlled laboratory cultures during September through November 1989.