短花针茅StbCRY1和StbCRY2基因克隆与表达差异分析

短花针茅（Stipa breviflora）是荒漠草原的优势物种,兼具优秀的饲用价值和稳固水土的重要作用,其生殖生长受外界环境的影响较大。探究野外短花针茅生长发育过程中的CRY1、CRY2蛋白对不同环境条件的响应关系,可以为进一步研究蓝光受体隐花色素在不利环境条件下短花针茅生长发育中的调控机制提供有用的信息。以短花针茅转录组数据为基础,利用RACE技术得到生物钟相关基因StbCRY1和StbCRY2 ORF,其编码区分别为2 695 bp和2 176 bp。二者编码酸性蛋白质,皆是亲水蛋白质。Stb CRY1蛋白具有Phr B结构域和Cry-C结构域,Stb CRY2蛋白具有PhrB结构域。进化树分析表明短花针茅CRY1蛋白与野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）和普通小麦（Triticum aestivum）CRY1进化关系较为相近,短花针茅CRY2蛋白与大麦（Hordeum innermongolicum）CRY2蛋白亲缘关系相近。利用生物信息学工具预测蛋白质二级结构,两种蛋白质出现α螺旋、无规线团概率为40%左右,出现β转角、延伸链的概率较小。共聚焦定位分析表明...     

中华按蚊气味结合蛋白AsinOBP62基因的克隆、表达及与人体挥发物的结合特性

嗅觉系统在蚊虫追寻宿主、寻找配偶、选择产卵场所等行为中起着重要的作用,气味结合蛋白与气味分子结合是昆虫嗅觉识别的第一步生化反应.为研究中华按蚊气味结合蛋白在追寻宿主中的作用,通过反转录PCR (RT-PCR)克隆气味结合蛋白62 (odorant binding protein 62,AsinOBP62)基因,利用定量...     

聚类GO术语在基因表达差异研究中的应用

针对基因功能分类体系基因本体(Gene Ontology,GO)特殊的有向无环图特点,改进传统的用单个GO术语检测基因差异表达信号的缺陷,设计出"聚类GO术语提升差异表达检测(ScaGO)"算法.通过简单的输入对照和实验组表达谱上的全部基因表达信号,来研究一些比较新的差异表达功能组,有助于进一步解释基因差异表达的生物学意义,如疾病发病机制、药物作用机理等.将ScaGO和基于单GO术语差异分析法应用到急性淋巴细胞性白血病数据集和酵母Rap1 DNA绑定突变体差异表达数据集上,结果显示,ScaGO能比基于单GO术语差异分析法发现一些新的与差异表达相关联的功能类基因,对于指导实验具有积极意义.图1表3参21     

麻疯树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达

从麻疯树胚乳cDNA文库中筛选分离了一个编码酰基载体蛋白的cDNA序列,全长为806 bp,其开放读码框(ORF)长度为393 bp.编码130个氨基酸,该序列在GenBanl澄录号为EF179617,命名为JcACP.该基因编码的蛋白质相对分子质量(M)约为14.4×103,等电点为5.2,具有酰基载体蛋白的典型特征--含有4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅基的结合位点.RT-PCR试验结果表明,该基因在麻疯树的叶、茎和种子中表达,以种子中的表达量最高,在根中不表达,种子萌发后其表达量随萌发进程递增,在96 h时表达量达到最高.结果表明,JcAcP在种子中的高度表达可能与种子萌发时的代谢活动有关.同时,将其在大肠杆菌中成功进行了原核表达.     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的克隆与表达

采用RTPCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增HO1基因,将该基因克隆进pGEMTeasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,分析基因,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子NisA的pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用Nisin诱导HO1表达,SDSPAGE和Westernblot分析、鉴定表达产物,并且用分光光度法测定工程菌表达的HO1活性为0.45nmolmg(protein)-1h-1.图5参18     

粉纹夜蛾颗粒体病毒全长增效基因在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术扩增了粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)颗粒体病毒增效基因全长片段,扩增产物用EcoRⅠ/HindⅢ双酶消化,经0.7%低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化后插入pRSET-B中,得重组表达质粒pRSET/enhancin;但重组子生长异常,在IPTG诱导下未能明显表达目标蛋白.用PstⅠ/HindⅢ双酶消化pRSET/enhancin,电泳回收2.7kb片段后插入pQE-30中,得重组表达载体pQE/enhancin;在IPTG诱导下于35℃成功表达出分子量(Mr)约为108×103的融合蛋白并命名为P108.初步纯化的P108显示了极显著的增效活性,对棉铃虫核型多角体病毒感染棉铃虫3龄幼虫的7d致死率提高34.03%,LT50缩短1.4d;对苏云金杆菌杀棉铃虫3龄幼虫的72h致死率提高65.96%.图4表2参14     

非纯培养物细菌蛋白酶DNA片段的克隆与表达

为了构建更多的蛋白酶基因工程菌,以及进行蛋白酶基因的直接进化研究,从非纯培养细菌总DNA中扩增各种编码蛋白酶的DNA片段.根据MEROPS和GenBank数据库中的枯草杆菌类蛋白酶的编码区和成熟肽编码序列设计并合成了10条引物.富集培养胞外蛋白酶产生菌并提取了12个总DNA样品,分别用每对引物在降落PCR (TouchdownPCR, TD-PCR)条件下进行蛋白酶编码序列的扩增.选择了19个长800 ~1 200 bp的扩增片段测序,其结果为: 8个是蛋白酶DNA片段,它们应属于4种不同的蛋白酶基因序列;同一对引物扩增到的基因序列差异性可达到32%,说明只使用基于已知序列的PCR方法从混合菌中获得新蛋白酶基因是可行的.将克隆到的1个与碱性蛋白酶E (GenBank No.AJ539133)的编码区99%相似的蛋白酶DNA片段插入pTWIN1载体,在大肠杆菌ER2566中进行表达.结果表明,表达的成熟蛋白酶可分泌到培养基中,能在牛奶平板上产生水解圈,对大肠杆菌有致死作用.图5表3参14     

假单胞菌反式氯双烯内酯异构酶基因克隆和序列分析

从土壤中分离得到一株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株GT241-1,从该菌株中克隆出参与降解2,4-二氯酚的反式氯双烯内酯异构酶基因(dcpE).克隆策略是采用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子.经序列测定得知,dcpE基因编码区1062bp.核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明,dcpE与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异.图5表1参12     

不同来源的苏云金芽孢杆菌aiiA基因表达及其抗病性分析

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)aiiA基因所编码的AiiA蛋白是一种内酯酶,可以降解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs),从而减弱致病菌产生的危害.本研究克隆了6株不同来源的苏云金芽孢杆菌aiiA基因,并对来自于苔藓(LLB15)和土壤(LLS9)的BtaiiA基因进行了生物信息学分析.结果表明,AiiA-B15分子量为27.97×103,等电点为4.59;AiiA-S9分子量为28.14×103,等电点为4.32,两者都是亲水性蛋白.AiiA蛋白具有很高的保守性,AiiA-B15和AiiA-S9同源性为90%.进化树结果表明,AiiA-B15与Bacillus thuringiensis subsp.kyushuensis进化距离最近,AiiA-S9与Bacillus cereus进化距离最近.将aiiA-B15基因克隆到pGEX-4T-3表达载体中,构建重组质粒pGEXaiiA-B15,IPTG诱导后可大量表达融合蛋白.对表达的条件进行优化.结果表明,0.6mmol/LIPTG,30℃下诱导3h为最佳诱导条件.致病性检测表明,该融合蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌具有较强的抗病作用.图13表4参23     

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b( ),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.图5参15     

烯酮还原酶基因的克隆与优化表达

烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.