不同16SrDNA靶序列对DGGE分析活性污泥群落的影响

为探讨不同通用引物扩增16S rDNA靶序列对活性污泥微生物群落分析的影响,更合理的利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析活性污泥样品.从连续流搅拌槽式反应器(CSTR)中获取活性污泥,以3对通用引物341f/534r、968f/1 401r和341f/926r扩增16S rDNA序列,用DGGE分离PCR扩增产物.研究表明采用不同引物对进行DGGE分析时,群落多样性和动态存在显著的差异.341f/534r和968f/1 401r的靶序列分离效果较好,341f/926r的靶序列分离效果较差.引物341f/534r和341f/926r DGGE图谱显示S2和S3相似性高,引物968f/1 401r DGGE图谱显示S1和S2相似性高.由此可见采用不同引物对进行DGGE分析时,群落结构之间的相似性和动态是不一致的.341f/534r的DGGE图谱中条带丰富,多样性最好,968f/1 401r的DGGE图谱次之,341f/926r DGGE图谱条带最少,多样性也较差.因此,在利用DGGE分析活性污泥样品时采用引物341f/534r和968f/1 401r是比较适宜的.     

不同16SrDNA靶序列对DGGE分析活性污泥群落的影响

为探讨不同通用引物扩增16S rDNA靶序列对活性污泥微生物群落分析的影响,更合理的利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析活性污泥样品.从连续流搅拌槽式反应器(CSTR)中获取活性污泥,以3对通用引物341f/534r、968f/1 401r和341f/926r扩增16S rDNA序列,用DGGE分离PCR扩增产物.研究表明采用不同引物对进行DGGE分析时,群落多样性和动态存在显著的差异.341f/534r和968f/1 401r的靶序列分离效果较好,341f/926r的靶序列分离效果较差.引物341f/534r和341f/926r DGGE图谱显示S2和S3相似性高,引物968f/1 401r DGGE图谱显示S1和S2相似性高.由此可见采用不同引物对进行DGGE分析时,群落结构之间的相似性和动态是不一致的.341f/534r的DGGE图谱中条带丰富,多样性最好,968f/1 401r的DGGE图谱次之,341f/926r DGGE图谱条带最少,多样性也较差.因此,在利用DGGE分析活性污泥样品时采用引物341f/534r和968f/1 401r是比较适宜的.     

Quantification of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in enrichment cultures by quantitative competitive PCR

The anaerobic ammonium-oxidizing (ANAMMOX) bacteria were enriched from a sequencing batch biofilm reactor (SBBR). A quantitative competitive polymerase chain reaction (QC-PCR) system was successfully developed to detect and quantify ANAMMOX bacteria in environmental samples. For QC-PCR system, PCR primer sets targeting 16S ribosomal RNA genes of ANAMMOX bacteria were designed and used. The quantification range of this system was 4 orders of magnitude, from 103 to 106 copies per PCR, corresponding to the detection limit of 300 target copies per mL. A 312-bp internal standard was constructed, which showed very similar amplification e ciency with the target amxC fragment (349 bp) over 4 orders of magnitude (103–106). The linear regressions were obtained with R2 of 0.9824 for 103 copies, 0.9882 for 104 copies, 0.9857 for 105 copies and 0.9899 for 106 copies, respectively. Using this method, ANAMMOX bacteria were quantified in a shortcut nitrification/denitrification-anammox system which was set for piggery wastewater treatment.     

饮用水中隐孢子虫qPCR检测研究

分子生物学的发展推动了分子技术在病原体检测诊断中的应用,建立成熟可靠的饮用水中隐孢子虫的分子检测方法也迫在眉睫.本研究直接提取饮用水浓缩液DNA,对隐孢子虫卵囊目的基因进行定量PCR(quantitative PCR,简称qPCR)检测,并对该体系进行了综合优化.本研究比较了不同冻融处理及不同DNA提取试剂盒对隐孢子虫卵囊DNA提取效果,结果显示,QIAamp DNA Mini kit配合冻融前处理(液氮/沸水5个循环)提取DNA含量较高,用这种方法可以提取到(4±1)个隐孢子虫卵囊DNA.本研究比较了隐孢子虫SYBR green染料法及Taqman探针法qPCR,结果显示,探针法和染料法均可以检测到10个18S rRNA基因拷贝(一个隐虫卵囊含有20个18S rRNA基因拷贝).采用该检测体系测定的去离子水和水源水中隐孢子虫的加标回收率分别达到了55%和46%;本研究提供了饮用水中隐孢子虫检测的一种可行性分子方法.     

基于16S rDNA不同靶序列对厌氧ABR反应器微生物多样性分析的影响

在反硝化抑制硫酸盐还原菌的研究中,探讨了不同引物扩增16S rDNA靶序列对厌氧ABR反应器的活性污泥DGGE图谱多样性的影响,从反应器中提取污泥总DNA,以4对通用引物341F/534R、968F/1401R、63F/534R、341F/926R扩增16S rDNA序列,对指纹图谱的分辨率和种群多样性进行分析.研究表明,采用PBS洗涤污泥和超声振荡有利于硫酸盐还原污泥总DNA提取;不同引物DGGE图谱分析,群落多样性存在显著的差异,341F/534R和968F/1401R的靶序列分离效果较好,341F/926R分离效果一般,63F/534R分离的效果最差.341F/534R的DGGE图谱中条带丰富,多样性最好,968F/1401R的DGGE图谱次之,341F/926R的DGGE图谱条带一般,63F/534R图谱条带最少,多样性也较差.建议DGGE分析厌氧活性污泥样品时,同时采用引物341F/534R和968F/1401R是比较适宜的.     

浅水湖泊(阳澄湖)沉积物氨氧化菌的分子证据

选择长江三角洲中型浅水湖泊--阳澄湖,应用分子生物学方法鉴定淡水系统底质中的厌氧氨氧化细菌和好氧氨氧化细菌.试验设计三组厌氧氨氧化特异性巢式引物,对沉积物细菌的16S rRNA进行特异性扩增.其中,引物对AMX368f-AMX820r从底质中扩增出了anammox特异性序列,系统发育分析表明样品序列分别与Candidatus brocadia fulgida、Candidatus brocadia anammoxidans和Candidatus scalindua属近似.应用amoA基因特异性探针在底质中扩增出的好氧氨氧化菌序列,均属于Betaproteobacteria.本研究提供了阳澄湖中好氧氨氧化菌与厌氧氨氧化菌共存的分子证据.     

中药废水污泥群落结构解析中PCR-DGGE引物的选择与评价

在中药废水生物活性污泥群落DGGE解析过程中,为了探讨16S rDNA通用引物的扩增效率和对污泥细菌群落的表征能力,选用包括简并性引物在内的11对通用引物扩增16S rDNA序列的4个可变区,并应用DGGE图谱评价不同引物的扩增效率和微生物种群多样性.结果表明,采用不同引物对进行DGGE分析时,微生物种群多样性存在着显...     

基于引物的湖泊沉积物氨氧化细菌PCR扩增策略比较

PCR扩增是检测环境中β-变形杆菌纲氨氧化细菌(β-AOB)群落的主要方法,但是引物的敏感性和特异性对结果具有关键影响.本研究首先比较了2组常用的β-AOB 16S rRNA基因引物,结果显示,在扩增一组不同性质湖泊沉积物样品时,βAMO引物均获得明亮的单一条带,但CTO引物则未能全部扩增.克隆及序列分析证实,βAMO引物扩增获得的序列均不属于β-AOB所在的Nitrosomonadales目,而CTO引物扩增获得的序列来自β-AOB中的Nitrosomonas europaea/"Nitrosococcus mobilis"分支.采用变性梯度凝胶电泳方法,对4种不同引物组合PCR策略扩增所得产物进行分析,发现以βAMO或16S rRNA通用引物结合CTO引物的巢式方案可以提高扩增的效率,且β-AOB的群落轮廓与CTO引物直接扩增方案高度相似.这些结果表明βAMO引物具有较高的敏感性但特异性较低,而CTO引物则相反.因此,特定巢式扩增方案既可提高扩增的效率,也能真实反映湖泊沉积物中β-AOB的群落轮廓,是较为理想的β-AOB研究方法.     

基于mcrA基因的厌氧颗粒污泥产甲烷菌群分析

基于mcrA基因对阿维菌素废水处理工业化UASB厌氧颗粒污泥中产甲烷菌群进行分析,并与基于16S rRNA基因的产甲烷菌群分析结果进行比较.结果表明,基于2种目标基因PCR产物的DGGE图谱存在差异,但根据图谱计算所得产甲烷菌群Shannon多样性指数、Margalef丰富度指数和Berger-Parker优势度指数没有差异,表明基于2种目标基因的产甲烷菌群多样性分析基本一致.基于不同目标基因的优势产甲烷菌群系统发育种属的分析结果大体相似,产甲烷杆菌目和产甲烷八叠球菌目是厌氧颗粒污泥样品中的优势产甲烷种群;同时,分析结果的差异表明2种目标基因的检测特异性不完全相同.基于2种目标基因的产甲烷菌群FISH杂交区域具有很高的一致性,但杂交区域面积有所差异.基于mcrA基因FISH检测的产甲烷菌群平均相对丰度为24.25%±6.47%,低于基于16S rRNA基因FISH检测结果(33.42%±2.34%).以上结果表明,基于mcrA基因与基于16S rRNA基因的的产甲污泥菌群分析结果具有较高的相似度,mcrA基因可以作为16S rRNA基因的替代目标基因.     

辛硫磷降解菌XSP-1的分离、鉴定及其降解特性研究

从农药厂污泥中分离到1株能以辛硫磷为唯一碳源生长的细菌, 命名为XSP-1.根据其生理生化特征和16S rRNA基因序列相似性分析, 将该菌株初步鉴定为戴尔福特菌属(Delftia sp.). 该菌株能在7 h内完全降解100　mg/L的辛硫磷. XSP-1降解辛硫磷的最适pH为7.0, 最适温度为35℃, 降解速率与初始接种量呈正相关, 该菌株对甲基对硫磷、毒死蜱、杀螟硫磷也有较好的降解能力. 根据已报道有机磷农药降解基因mpd的保守序列设计引物, 未从该菌株中扩增到目标条带, 但是该菌株是否带有新的有机磷农药降解基因仍需要进一步研究.     

Analysis of bacterial community structures in two sewage treatment plants with different sludge properties and treatment performance by nested PCR-DGGE method

The bacterial community structures in two sewage treatment plants with different processes and performance were investigated by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE） of nested polymerase chain reaction （nested PCR） amplified 16S rRNA gene fragments with group-specific primers. Samples of raw sewage and treated effluents were amplified using the whole-cell PCR method, and the activated sludge samples were amplified using the extracted genomic DNA before the PCR products were loaded on the same DGGE gel for bacterial community analysis. Ammonia-oxidizing bacterial and actinomycetic community analysis were also carried out to investigate the relationship between specific population structures and system or sludge performance. The two plants demonstrated a similarity in bacterial community structures of raw sewage and activated sludge, but they had different effluent populations. Many dominant bacterial populations of raw sewage did not appear in the activated sludge samples, suggesting that the dominant bacterial populations in raw sewage might not play an important role during wastewater treatment. Although the two plants had different sludge properties in terms of settleability and foam forming ability, they demonstrated similar actinomycetic community structures. For activated sludge with bad settling performance, the treated water presented a similar DGGE pattern with that of activated sludge, indicating the nonselective washout of bacteria from the system. The plant with better ammonium removal efficiency showed higher ammonia-oxidizing bacteria species richness. Analysis of sequencing results showed that the major populations in raw sewage were uncultured bacterium, while in activated sludge the predominant populations were beta proteobacteria.     

三苯基甲烷类染料氧化酶基因(tpmD)在大肠杆菌中的无诱导表达

为了解决嗜水气单胞菌DN322对鱼类的潜在致病性问题,有必要克隆表达该菌的三苯基甲烷染料脱色酶基因tpmD.通过PCR方法获得该基因,并与脱色希瓦氏菌S12的NAD(P)H脱氢酶基因启动子和用于荧光标记的编码CCPGCC的碱基序列融合,将有启动子和无启动子的融合基因片段分别连接到质粒pMD18-T中,转化大肠杆菌E.coli DH5α和E.coli BL21.结果发现,有启动子的融合基因能被E.coil在不加诱导物IPTG的条件下高效正确表达,脱色酶活性甚至超过基因供体菌DN322.将上述两株大肠杆菌工程菌株在自然水体中进行孔雀石绿污染小试处理,60d内在每个350mL反应体系中累积共投加大于10000mg的孔雀石绿,脱色率一直保持在92%以上;细菌数量最后增加了5～10倍.研究结果证明,基因工程菌在不加营养物的条件下也有很强的脱色活性和长期的存活能力;在tpmD基因3'端加入的用于螯合双砷荧光染料的18bp编码氨基酸碱基序列不影响此基因的表达和酶的脱色活性,这将赋予此工程菌可示踪性.     

厌氧氨氧化菌的富集培养与分子鉴定

采用传统培养方法与分子生物学方法相结合,进行了厌氧氨氧化菌的分离培养与分子鉴定.富集培养以2种不同反应器的厌氧氨氧化污泥作为分离源,以亚硝酸盐与铵盐为底物.经过2 a传代培养获得2个培养系,对亚硝酸盐及铵盐具有稳定的去除能力,氨氮去除率为85%左右.通过16S rRNA克隆文库方法对培养系中浮霉菌门微生物群落结构进行了多样性解析,结果表明2个培养系中的厌氧氨氧化菌是同一种微生物,代表序列比对结果与"Kuenenia stuttgartiensis"同源性为99%.采用"K.stuttgartiensis"的特异探针对培养系进行了荧光原位杂交分析(FISH),进一步证实"K.stuttgartiensis"是培养系中的优势厌氧氨氧化菌,占总菌群数的80%～90%.对反应器中"K.stuttgartiensis"的丰度变化进行了FISH跟踪检测,发现原始接种污泥中"K.stuttgartiensis"为主要厌氧氨氧化菌,经过2 a运行该菌在污泥中的丰度由11%提高到24%.     

降解多环芳烃的菌株Gordonia sp.He4的分离鉴定及其在菲污染土壤修复过程中的动态变化

从石油污染土壤中分离得到1株降解石油烃类污染物的He4菌株.该菌株能够以正十六烷、苯、萘、蒽、菲和芘作为唯一的碳源生长.经过对其形态特征、生理生化、以及16S rRNA基因序列分析,该菌株初步鉴定为Gordoniasp..通过分析其16S rRNA基因序列,设计引物并构建了竞争性模板.通过竞争性定量PCR（quantitative competitive-PCR）分析了该菌株在含有菲的污染土壤中数量的变化.结果表明,部分菌株He4在土壤中转变为不可培养状态,采用传统的稀释涂布菌落计数法（CFU）无法对其进行定量,而通过QC-PCR能够较准确地测定土壤中微生物的动态变化.     

Pronounced temporal changes in soil microbial community and nitrogen transformation caused by benzalkonium chloride

As one typical cationic disinfectant, quaternary ammonium compounds (QACs) were approved for surface disinfection in the coronavirus disease 2019 pandemic and then unintentionally or intentionally released into the surrounding environment. Concerningly, it is still unclear how the soil microbial community succession happens and the nitrogen (N) cycling processes alter when exposed to QACs. In this study, one common QAC (benzalkonium chloride (BAC) was selected as the target contaminant, and its effects on the temporal changes in soil microbial community structure and nitrogen transformation processes were determined by qPCR and 16S rRNA sequencing-based methods. The results showed that the aerobic microbial degradation of BAC in the two different soils followed first-order kinetics with a half-life (4.92 vs. 17.33 days) highly dependent on the properties of the soil. BAC activated the abundance of N fixation gene (nifH) and nitrification genes (AOA and AOB) in the soil and inhibited that of denitrification gene (narG). BAC exposure resulted in the decrease of the alpha diversity of soil microbial community and the enrichment of Crenarchaeota and Proteobacteria. This study demonstrates that BAC degradation is accompanied by changes in soil microbial community structure and N transformation capacity.     

应用荧光原位杂交方法检测赤潮异弯藻

根据对赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)核糖体大亚基(LSU)和核糖体转录单元内间隔区 (ITS) 序列信息的分析,设计了以胞质rRNA和胞核rDNA为靶序列的特异性探针,建立了赤潮异弯藻的全细胞和细胞核荧光原位杂交快速检测方法.结果表明,探针能分别使整个细胞质和细胞核呈现强烈的绿色荧光;探针是特异性的,不与其他受试藻进行交叉反应.同时,用该方法成功的从模拟自然海区混合样品中检测出赤潮异弯藻.该研究方法可以适用于对实验室和自然海区赤潮异弯藻样品的快速、准确、特异和半定量检测.     

MnO2强化厌氧氨氧化工艺启动及其微生物机理研究

通过对照试验考察了添加MnO₂对厌氧氨氧化污泥驯化和培养的影响,并采用16S rRNA基因高通量测序技术和定量PCR分析其机理.结果表明,添加MnO₂粉末能够显著提高容积氮负荷及运行性能,其脱氮速率高达848.04 mg·L^-1·d^-1,几乎是对照组反应器的2倍.16S rRNA基因高通量测序技术和定量PCR结果表明,添加MnO₂粉末促进了典型厌氧氨氧化菌Candidate Brocadia的富集,厌氧氨氧化菌16S rRNA基因和功能基因hzsB的丰度显著提高.