生物硝化池污水中硝化细菌的快速定量研究

实验采用聚合酶链式反应（PCR）技术与最大几率数法（MPN）相结合的MPN－PCR法对生物硝化池污水中的硝化细菌进行快速定量。所用的一对PCR引物是在对硝化细菌的16SrRNA基因进行系统比较的基础上设计合成的，可以扩增出大小为388bp的DNA片段。以从生物硝化池污水中抽提的含硝化细菌DNA的混合DNA为模板，进行PCR扩增并确定合适的扩增条件。运用MPN－PCR法进行定量检测的整个过程可在几小时之内完成。     

Quantitative Detection of Virulence Genes eaeA and rfbE of Pathogenic Escherichia coli in Municipal Wastewater by Real-Time PCR

针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法.利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性.将重组质粒作为模板,分别测定标准曲线,在eaeA基因模板量8.77～8.77×105 copy,rfbE基因模板量4.98 ～4.98×105copy的范围内,Ct(循环阈值)与模板量的对数值具有良好的线性关系[ R2为0.997( eaeA)和1.000(rfbE)].结合膜吸附洗脱浓缩方法,对于实际水样,eaeA和rfbE基因的检测限分别为1.75×102和9.96×101copy/100 mL.利用该方法对城市污水处理厂进、出水进行检测的结果显示,污水二级处理工艺对这2种毒力基因的去除效果明显.     

环境样品中亚硝酸细菌amoA基因的克隆与测序

对从环境样品中分离的亚硝酸细菌(Ammonia oxidizingbacteria)amoA基因进行克隆与测序,为构建基因工程菌打下基础。采用亚硝酸细菌选择性培养基,从4个不同的畜牧养殖污水处理厂采集的样品(分别编号为1,2,3,4)在室温下富集培养2个月后,采取酚氯仿抽提的方法提取DNA。根据已报道的亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)amoA基因序列,设计引物AMOB AMOE,并在AMOB,AMOE的5′-端分别加上了BamHⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点,以利于进一步酶切和克隆。用AMOB AMOE对4种样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,4种样品中1号和3号样品扩增得到预期长度的DNA片段,2号和4号样品扩增没有得到预期片段。回收纯化PCR产物与pGEM-T载体连接,构建amoA基因测序载体,并转化E.coliM15。测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果显示,扩增得到的DNA片段均与Nitrosomonassp.GH22的amoA基因有99 7%的同源性,可从环境中分离的亚硝酸细菌中克隆出amoA基因。      

城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eaeA和rfbE的实时荧光定量PCR检测

针对病原性大肠埃希氏菌EHEC和EPEC的毒力基因eaeA和rfbE,选用特异性引物,建立了实时荧光定量PCR检测方法. 利用从污水中分离出的目的核酸片段构建重组质粒,通过测序和BLAST比对分析,确定了PCR扩增的特异性. 将重组质粒作为模板,分别测定标准曲线,在eaeA基因模板量8.77～8.77×105 copy,rfbE基因模板量4.98～4.98×105copy的范围内,Ct(循环阈值)与模板量的对数值具有良好的线性关系〔R2为0.997(eaeA)和1.000(rfbE)〕. 结合膜吸附洗脱浓缩方法,对于实际水样,eaeA和rfbE基因的检测限分别为1.75×102和9.96×101copy/100 mL. 利用该方法对城市污水处理厂进、出水进行检测的结果显示,污水二级处理工艺对这2种毒力基因的去除效果明显.      

以化学抑制法研究污水生物处理过程中N2O的释放源

采用化学抑制法,研究了不同曝气量下污水生物处理过程中N2O的释放源.结果表明,缺氧段中, N2O的主要释放源为硝酸盐异化成氨反应,而反硝化反应消耗N2O.好氧段中N2O释放源受曝气量的影响很大,当曝气量适中时(65L/h), N2O释放源主要为硝化细菌反硝化作用;而当曝气量偏高(105L/h)或偏低(25L/h)时,同步硝化-反硝化反应是主要的N2O释放源.同时硝化细菌反硝化反应也能够产生少量N2O.     

活性污泥中高效硝化细菌的分离与初步鉴定

为了获取污水生物脱氮中的高效硝化细菌,本文利用硝化细菌分离培养基从青岛市某生活污水处理厂活性污泥中分离得到1株以亚硝酸钠为氮源进行好氧硝化作用的细菌,命名为菌株N-2,并对该菌株的基本形态、生理生化性质和硝化能力等进行了研究与初步鉴定。结果表明:菌株N-2革兰氏染色为阴性,呈杆状,菌落为乳白色,初步鉴定该菌株属于硝化杆菌属(Nitrobacter);好氧条件下,菌株N-2在亚硝酸钠初始浓度为1g/L的硝化细菌无机盐基础培养基中培养8d,其最大硝化速率可达到8.7mg/(L.d),表明该菌株具有高效利用亚硝态氮的能力。     

其他

离子对亚硝化细菌的毒性影响。在相应的运行控制条件下,通过中试运行效果得出结论:对于含较高质量浓度重金属的城市污水,用刀O工艺进行生物脱氮在技术上是可行的,经过驯化的硝化菌、反硝化菌尚能忍受较高的重金属质量浓度;在合适的条件下,可获得良好的脱氮效果。该工艺能满足此污水处理厂的功能要求。图3表7参5X7的.301饮食业油烟污染与治理技术现状/赵建伟(东北师范大学环境科学与工程系)…//环境污染治理技术与设备/中科院生态环境研究中心一2(X)3,4(2)一63一65环图X一4X799 .3032(X) 303038压力容器活性污泥法处理餐厅生活污水/罗爱武…     

制药废水受纳河流中四环素抗药基因及微生物群落结构变化研究

考察了含有土霉素制药废水的污水处理厂排放在冬季和夏季对受纳河流中四环素抗药基因及微生物群落结构的影响.利用PCR方法,对该河流中16种四环素抗药基因(TRGs)进行了检测,其中6种在排放口及下游被检出.通过Real-timePCR对其中的3种抗药基因(tet(L)、tet(W)和tet(X))及总细菌的16SrRNA基因进行定量分析(TRGs/16SrRNA基因),结果表明:tet(L)、tet(W)和tet(X)与16SrRNA基因的比值在排放口和下游(3.34×10-3～2.38×10-1)显著高于排放口上游(1.16×10-5～2.38×10-2),表明污水排放造成了抗药基因的增加.夏季河水中TRGs/16SrRNA基因明显低于冬季.利用PCR-DGGE对不同河流沉积物中微生物群落结构进行了研究,结果表明,污水的排放显著改变了河流中的微生物群落结构,一些代表性TRGs宿主细菌的条带在排放点和河流下游明显增加.     

序批式生物反应器填埋场脱氮微生物多样性分析

为探究序批式生物反应器填埋场脱氮过程中的微生物作用机制,本研究采用建立脱氮功能基因(amoA、nosZ)克隆文库及PCR-RFLP技术对序批式生物反应器填埋场垃圾稳定化后期的主要脱氮功能微生物多样性进行分析.结果表明,矿化垃圾反应器中检测到的氨氧化细菌存在高度多样性,大部分为未知类群,且均为不可培养菌或未经分离获得的细菌,经系统发育树分析系统内氨氧化细菌以β-变形菌门中的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)为主;新鲜垃圾反应器中反硝化细菌种群丰富,主要有β-变形菌纲中的陶厄氏菌属(Thauera)和硫杆菌属(Thiobacillus).Thauera属在好氧条件下具有反硝化特性,Thiobacillus属中的脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)是一种硫自养反硝化菌,可见新鲜垃圾单元稳定化后期以好氧反硝化和自养反硝化的脱氮途径为主.此外文库中检测到的一部分反硝化细菌可能归属于α-变形菌纲的慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae).     

PCR-DGGE研究处理垃圾渗滤液序批式生物膜反应器(SBBR)中的细菌多样性

为了研究序批式生物膜反应器中的细菌多样性及其脱氮的微生物学机理,为工艺改进提供依据,从同步高效去除垃圾渗滤液中高氨氮和高COD的SBBR生物膜和渗滤液原水中采集微生物样品并提取微生物总DNA,使用细菌通用引物对（GC341F/907R）从总DNA中成功扩增出目标16S rDNA片段,然后对扩增的16S rDNA进行DGGE,对凝胶染色并进行条带统计分析和切胶测序,使用序列数据进行同源性分析并建立了系统发育树.结果表明,该驯化后的SBBR生物膜和渗滤液原水中都有比较丰富的细菌多样性,驯化的生物膜细菌主要来自渗滤液原水,而且生物膜细菌在反应器正常运行时不会出现明显的群落结构变化;在该SBBR中有多种硝化细菌与反硝化细菌、好氧反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌共存,说明该反应器中可能同时存在全程硝化反硝化、同步硝化反硝化和厌氧氨氧化3种脱氮方式.研究结果为SBBR脱氮微生物机理研究提供了一些有价值的参考依据.     

控制污水生物处理过程中N_2O的释放

文章通过对国内外污水生物脱氮过程中氧化亚氮(N2O)产生途径最新研究成果的总结,着重讨论了污水生物处理过程中N2O释放的控制措施。在硝化过程中,N2O由氨氧化菌(AOB)的中间产物羟胺(NH2OH)和硝酰基(NOH)的分解以及AOB还原亚硝酸盐的过程产生;反硝化过程中,N2O还原酶(N2OR)的活性受到抑制,使得N2O不能被及时被还原而导致N2O积累。基于上述N2O产生途径提出了控制N2O释放量的控制措施:控制曝气量避免好氧硝化过程中DO浓度过低和缺氧反硝化过程中存在DO;通过延长污泥龄、增大内回流比和分段进水等措施控制硝化和反硝化过程中的亚硝酸盐浓度:缩短初沉池停留时间或投加外碳源,并选取甲醇或乙醇等易降解有机物作为碳源。今后可通过深入研究N2O产生机理和优化污水处理厂N2O释放量的准确检测,充分认识污水处理厂中N2O的产生环节,进一步指导污水厂N2O的释放控制。     

水稻土细菌硝化作用基因（amoA和hao）多样性组成与长期稻草还田的关系研究

以中国科学院桃源农业生态试验站长期定位试验的土壤样品为对象,采用PCR扩增、克隆文库构建以及序列测定等分子生物学技术分析稻草还田对亚硝化功能基因amoA和hao多样性的影响.结果表明,水稻土稻草还田处理(氮磷钾+水稻秸秆,SR)降低了amoA和hao基因的多样性,其Shannon指数分别为3.7和3.2;而氮磷钾处理(CK)的Shannon指数达到4.0和3.7.LIBSHUFF分析比较CK和SR处理克隆文库的差异,结果显示amoA和hao基因处理间群落结构p值分别为0.002和0.001,均达到极显著水平.序列分析结果表明,对于amoA基因,只检测到与亚硝化螺菌属(Nitrosospira)相似的以及与未知的amoA基因相似的基因,并且与Nitrosospira相似的只出现在SR处理中,相似率达96%以上,而与未知的amoA基因相距最近的已知菌属也是Nitrosospira;获得的hao基因则分布于变形菌门(Proteobacteria)中的3个纲(α、β、γ),其中CK处理获得的hao基因主要与Silicibacter、甲基球菌属(Methylococcus)相似,SR处理获得的基因主要与亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)亲缘关系较近.系统发育树分析显示亚硝化基因(amoA、hao)在这2个处理中可被分为4个基因簇(Cluster),稻草还田使亚硝化细菌群落发生了明显的分异,出现了基因聚类现象,并且在amoA基因树图中出现了只由SR处理构成的分支(ClusterⅣ).总体来说,长期稻草还田降低了亚硝化基因amoA和hao的多样性,明显改变了亚硝化细菌群落结构.     

养猪废水中试规模亚硝化-反硝化-厌氧氨氧化组合工艺脱氮效能及群落结构分析

与传统硝化-反硝化工艺对养猪废水脱氮处理相比,厌氧氨氧化(Anammox)是一种更为绿色节能的污水生物脱氮工艺,但缺乏成熟的大规模养猪废水处理的工程应用案例.因此,本研究开展厌氧氨氧化技术应用于猪场废水处理的中试项目,采用一体化集装箱式组合工艺,主要包括前置反硝化池、亚硝化池、亚硝化-厌氧氨氧化池(PN-A池).结果表明,中试设备稳定运行阶段,处理规模为2 m³·d^-1,总氮去除率为93.93%±0.44%,有机物(以COD计)去除率为84.43%±0.84%,表现出良好的脱氮除碳能力.高通量测序分析结果表明,Nitrosomonas为系统中主要的好氧氨氧化菌,在亚硝化池和PN-A池都有显著富集,其相对丰度最高可达7.50%;亚硝化池亚硝氮积累率为74.28%,系统能够实现稳定亚硝化.反硝化池中主要的反硝化功能细菌为Thauera和Halomonas.Candidatus Kuenenia是系统中唯一检测到的AnAOB,只存在于PN-A池中,稳定运行期间其在填料上的相对丰度较悬浮污泥中的相对丰度高0.76～10.95倍.综上所述,厌氧氨氧化一...     

多级A／O膜生物反应器污泥活性研究

采用一种新型的多级A／O膜生物反应器处理污水,对该工艺的污泥活性进行了研究。结果表明,VSS／SS在实验过程中呈较弱的下降趋势,多级A／O池曝气室污泥比硝化速率逐室下降,但各缺氧室污泥比反硝化速率基本一致;污泥释磷、聚磷过程在30 min和1 h内基本完成,反硝化聚磷试验表明污泥中存在DPB的富集,反硝化作用是反硝化细菌与DPB共同作用的结果。     

生物陶粒与生物活性炭上微生物群落结构的PCR-SSCP技术解析

采用PCR-SSCP(单链构象多态性)技术,以16S rRNA基因的V4-V5区为靶对象,分析用于饮用水处理的生物陶粒和生物活性炭上的微生物群落结构.对生物陶粒和生物活性炭上的微生物分别进行超声波洗脱、R2A和LB平板培养后提取基因组DNA.结果表明,除生物活性炭超声波洗脱不能提取到DNA外,其他处理均能提取到大小在10 kb以上的基因组DNA,但所提取的量有较大差异.以提取的DNA为模板分别进行PCR,均能扩增到408 bp的基因片段.这些片段经λ核酸外切酶消化处理后进行SSCP电泳.结果显示,超声波洗脱、R2A和LB培养对试验结果影响不明显.生物陶粒的微生物基因扩增片段SSCP图谱相同,且只出现1条带.测序后与基因组数据库对比,结果显示其与uncultured Pseudomonas sp. clone FTL201 16S rDNA （GenBank登录号AF509293.1）片段同源性为92%.生物活性炭的微生物基因扩增片段SSCP图谱也相同,但有2条带.测序对比的结果表明, 这2个基因片段与Bacillus sp. JH19 16S rDNA （GenBank 登录号DQ232748.1）片段和Bacterium VA-S-11 16S rDNA （GenBank登录号AY395279.1）片段的同源性分别为100%和99%.     

生物强化技术改善太湖梅梁湾水源地水质的研究

采用海绵状立方体新型载体ACP和PM2种材料,通过生物强化技术来改善太湖梅梁湾水源地水质.静态实验结果表明,生物强化技术对湖泊水体中的TN、NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N、TP、PO₄^3--P、Chl-a的平均去除率分别达到了83.13%、80.80%、70.57%、78.05%、62.71%、78.06%、84.77%.载体上生物量和生物活性的监测结果表明,载体ACP和载体PM具有很强的富集生物和提高生物活性的能力,富集后的生物量和生物活性能分别达到31.23,32.58μg/g、158.32,165.12μgTF/g.FISH检测技术发现,载体表面上富集硝化细菌(硝化菌、亚硝化菌)数量能分别达到6.4×10¹⁰个/g.PCR技术、16SrRNA分析表明,假单胞菌(Pseudomonas sp.)和芽孢杆菌(Bacillussp.)作为优势溶藻细菌富集,富集的丰度达到1.62%.     

环介导等温扩增(LAMP)技术检测水源病原菌

微生物指标是水质安全的重要指标之一,但是由于技术原因,大部分病原微生物并未被纳入水质监测中。目前各类水质标准中只有病原指示微生物的指标,然而这些指标与病原微生物的相关性并不理想。因此,开发快速简便的病原微生物检测技术是改进水质生物检测和监测的关键。环介导等温扩增技术是一种快速检测DNA且不依赖昂贵检测设备的PCR技术。尝试利用该技术检测水中的8种常见指示菌和病原菌:总大肠杆菌、沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7、小肠耶尔森氏菌、嗜肺军团菌、绿脓杆菌和结核杆菌,获得了针对其中5种细菌的毒力基因的特异性引物和最优等温PCR条件。环介导等温扩增技术的灵敏度可在45min内检测出100个基因拷贝,并能在原污水中对病原菌进行定性检测。     

养殖场周边环境污染对畜禽养殖质量影响研究——以基于DNA条形码技术的黄牛肉质检测物研究为例

当前养殖场周边环境严重影响畜禽类的养殖质量,以基于DNA条形码技术的黄牛肉质检测物研究为例,对黄牛肉的真伪进行了检测。对黄牛种类特异性基因COI基因(NC_006853.1)序列进行设计,利用DNA提取、DNA纯度和浓度测定、PCR扩增、电泳检测、DNA纯化和回收、DNA克隆,完成肉质真伪的检测。得到电泳检测结果,真正黄牛肉扩增片段长度为534 bp,其余肉品样本不能扩增出534 bp。实验结果表明,该检测方法操作方便,检测时间短,应用前景较好,可以满足市场肉类监督检测需要。     

现代非培养技术在反硝化微生物种群结构和功能研究中的应用

反硝化过程对于废水生物脱氮工艺的运行、土壤肥分的流失以及N2O的排放均具有重要意义,但参与反硝化过程的微生物种类繁多且多数不可培养,导致对自然环境中反硝化微生物的种群结构及功能的研究具有很大难度.现代非培养分子技术的发展使得对反硝化微生物进行原位、准确、全面的研究成为可能.对反硝化功能基因进行指纹图谱分析、定量PCR或者利用FISH等技术可以有效确定反硝化菌的组成和数量,通过检测反硝化酶和mRNA可将反硝化菌的种群鉴定与代谢活性联系起来,最近新出现的同位素底物标记技术甚至可直接确定反硝化菌的碳源利用情况.重点介绍了上述各种现代非培养技术对反硝化细菌种群结构和功能的研究现状,以期为深入了解反硝化微生物的多样性和功能特性提供参考.     

硝化负荷对A~2O-BAF中试系统性能的影响

该文建立了一套中试规模"厌氧/缺氧/短时好氧(A2O)-曝气生物滤池(BAF)工艺",日处理量19.2 m3/d,考察了BAF池硝化负荷对系统处理性能的影响。该工艺由A2O池、中沉池和BAF池三部分构成,其中,A2O段HRT为4.0 h,厌氧/缺氧/好氧体积比为1∶2∶1;BAF池最初只有1座,后来改为2座,硝化负荷从0.8 kg NH4+-N/(m3·d)降至0.4 kg NH4+-N/(m3·d),硝化液回流比100%。结果表明,随着硝化负荷的降低,系统去除效果明显改善,氨氮和总氮去除率分别从66.2%和51.7%提高到88.0%和69.9%,SS去除率也从55.6%升至82.3%;COD去除效果保持稳定,平均去除率82.5%。可见,BAF容积负荷是影响A2O-BAF工艺处理性能的关键参数,将硝化负荷控制在0.4 kg NH4+-N/(m3·d)可保证系统出水达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A标准。