恶臭假单胞菌KT2440高效电转化方法

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440是模式环境微生物菌株,也是异源表达的良好宿主菌.高效率的电转化方法对于基因的引入及后续实验非常关键.通过条件优化,建立了高效的电转化方法.EM培养基培养菌体至D600nm=0.6～0.75,冰冷的3mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,pH=7.0)的缓冲液洗涤菌体3次,菌体浓缩300倍,50μL分装并用于一次电转化.电转化条件:1.2kV,200Ω,25μF.1mL SOC培养基悬浮后,转至15mL聚丙烯离心管培养2h,转化效率可高达3.0×108转化子/μg,比目前为止文献报道的该菌株电转化效率高出30倍左右.实验结果还表明,转化DNA浓度与转化子数目呈线性关系.     

甲基对硫磷降解菌GFP标记菌株的构建

用Sau3AⅠ酶切甲基对硫磷降解菌DLL 1总DNA ,与BamHⅠ酶切的启动子探针载体 pRobe -GFP酶连 ,转化E .coliDH5α ,在选择性平板LB(Ampr)上从大约 1× 10 4个菌落筛选到 5 0个含启动子片断的阳性克隆 .挑选其中一个阳性克隆 ,将启动子片断克隆到pIJ2 92 5和 pBBR -MCS2上构建成重组质粒 pIJGFP和广宿主标记载体pB BRGFP .然后将 pIJGFP载体上的启动子片断克隆到广宿主载体 pTR10 2上 ,获得第二个广宿主标记载体pTRGFP .将pTRGFP和pBBRGFP通过三亲接合分别标记于DLL 1得到两株标记菌 ,即DLLTR和DLLBR .通过激光共聚焦显微镜观察和软件Lasersharpversion 3.2分析发现 pTRGFP在E .coli中表达很强而在DLL 1中表达很弱 ,而 pBBRGFP正好相反 .图 5表 2参 12     

十二烷基硫酸钠降解菌株Pseudomonas sp. SDS-2的降解能力及其低温降解活性的调控（英文）

尽管生物法已广泛用于表面活性剂废水的处理,但低温对微生物的代谢活性产生明显不利影响,导致出水难以稳定达标.对筛选到的十二烷基硫酸钠(SDS)降解菌的降解能力进行考察,并对不同调控策略作用下该菌株的低温降解活性进行评估.对筛选到的菌株进行16S rRNA基因序列测定与分析.该菌株在不同温度、pH、底物浓度、接种量下的降解能力以及不同调控策略(低温驯化、外源物质添加)下的低温降解活性均以化学需氧量(COD)的去除率间接表示.结果筛选到一株SDS降解菌,命名为SDS-2. 16S rRNA基因序列分析表明该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.).该菌株的最佳生长条件为30℃、pH 9和120 mg/L氨浓度,而接种量对其降解活性无明显促进作用.当SDS初始浓度为2 500 mg/L时,该菌株对SDS的去除速率(以COD计)可达到355.3 mg L~(-1) h~(-1). 15℃下,长期驯化可使该菌株的降解活性达到30℃时的水平;10℃下,添加外源物质丁二酸钠和硝酸钾可使COD的去除率在48 h内分别提高25.3%和24.6%;外加蛋白胨和复合维生素可使COD的去除率在24 h内分别提高22.8%和11.7%.本研究筛选到的Pseudomonassp.SDS-2具有高的SDS降解活性,可为实际含SDS表面活性剂废水的处理提供微生物资源;同时,本研究中的调控策略亦可为SDS低温生物处理提供潜在处理方法.     

有机磷农药降解菌的紫外诱变育种

有机磷农药降解菌地衣芽孢杆菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） 经紫外线诱变后,筛选出突变菌株Ｐ１２ ．在θ＝３０℃,溶解氧ρ（Ｏ２） ＝２ ．５ ｍｇ Ｌ－１ 的培养条件下,３ ｄ 内对甲胺磷的降解率为８０ ．１％ ,比出发菌株提高了将近１０％的降解率．农药斜面连续传代１０ 次,降解活力保持稳定．     

原生质体转化构建有机磷农药降解工程菌

降解有机磷农药甲胺磷、敌敌畏和对硫磷的菌株地衣芽孢杆菌 Ｐ１２（ Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） 经溶菌酶处理获得原生质体,加入降解乐果的供体菌 Ｇ１ Ｄ Ｎ Ａ,经ρ（ Ｐ Ｅ Ｇ６ ０００） ＝ ３００ ｇ Ｌ－ １ 诱导,在液体再生培养基中振荡培养ｔ＝ ２０ ｈ ,使其恢复细胞壁后,离心收集菌体,涂布于含乐果的基础培养基上,经筛选得一转化子 Ｊ Ｐ Ｚ．其菌落形态明显不同于出发菌株,乐果平板连续传代１０ 次,性状保持稳定．在θ＝ ３０ ℃,１００ ｒ／ｍｉｎ 的培养条件下,３ ｄ 内对ρ（ 甲胺磷） ＝ ０ ．５ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 敌敌畏） ＝ ０ ．２ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 对硫磷） ＝ ０ ．１ ｇ Ｌ－ １ ,ρ（ 乐果） ＝ ０ ．３ ｇ Ｌ－ １ 的降解率分别为 Ｒｄ ＝ ７９ ．１ ％ ,４６ ．７ ％ ,２９ ．４ ％ 和４６ ．４ ％ ．     

烷烃降解菌的筛选、鉴定及优势菌株的降解特性

以正庚烷为唯一碳源,从长期受到石油污染的土壤中筛选获得可利用正庚烷的微生物14株.通过形态观察和16S rDNA序列比对,鉴定G2、G9、G14为红球菌属,G3、G27为人苍白杆菌属,G4、G7为芽孢杆菌属,G5、G10、G15、G25为节杆菌属,G16为缺陷短波单胞菌,G17、G22为嗜麦芽寡养单胞菌属.通过考察其降解烷烃的能力,确定Rhodococcus sp.G2为烷烃降解优势菌株.该菌株可代谢庚烷获得最大菌体浓度D600 nm=7.51.同时该菌对不同碳链长度的烷烃,如十二烷、十六烷、煤油和二甲苯均具有较强的降解能力,以十二烷为碳源的最大比生长速率为0.37 h-1,最高菌体浓度为D600 nm=12.00,在正十六烷中生长,最大比生长速率为0.23 h-1,在煤油中生长,最大比生长速率为0.14 h-1,在以二甲苯为唯一碳源时,D600 nm也可达到1.00左右.研究表明该菌株对于石油污染土壤的生物修复有很大的应用前景.图6表2参9     

DLL-1菌对甲基对硫磷农药的降解作用及其降解机理

研究了假单胞菌 (DLL - 1)在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能与影响因素及其降解机理。结果表明 ,当菌体浓度为 10 5个·ml-1时 ,即发生快速的降解作用 ,3h时 ,降解率达 88.5 %。在pH为 5 .0、7.0和 9.0条件下 ,DLL - 1菌均产生对甲基对硫磷农药的高效降解作用。采用气相色谱 -质谱联用技术与离子色谱法 ,测定了DLL - 1菌 -甲基对硫磷作用过程产生的中间产物和最终产物 ,表明对硝基苯酚为主要中间产物 ,且DLL - 1菌能将其进一步降解为NO2 -和NO3 -。     

甲胺磷农药降解菌HS-A32的分离鉴定及降解特性

从长期受有机磷农药污染的土壤中分离到一株降解菌HS-A32,能以甲胺磷作为唯一的碳源和氮源生长.HS-A32菌降解甲胺磷的最适温度为30℃,最适pH值为7.0,甲胺磷的最适降解浓度为1 000 mg/L,降解率达82%.聚酰胺薄层色谱(TLC)可检测到降解产物中有NH4 生成.HS-A32菌能以多种碳、氮源生长,外加可利用的碳源和氮源能促进甲胺磷的降解.通过16S rDNA扩增、测序,运用BLAST检索分析,构建系统进化树.结合生理生化鉴定,初步确定HS-A32为不动杆菌属(Acinetobacter).HS-A32菌还能降解甲基对硫磷等多种有机磷农药.图6表1参14     

蜡状芽孢杆菌不同菌株降解有机磷农药的特性分析

筛选分离降解微生物解决有机磷农药残留给水体和土壤环境带来的污染问题是一项可行的生物修复技术。采用富集培养和定时取样分析有机磷农药残留的方法,分离驯化出三株能够降解有机磷农药的细菌,研究了其形态特征和生理生化特性并对其16SrDNA序列进行了分析,同时比较了三菌株对甲基对硫磷（Methyl－parathion）、毒死蜱（Chlorpyrifos）和_二唑磷（Triazophos）的降解特性。结果表明：通过富集培养得到10菌株具有降解甲基对硫磷和毒死蜱的能力,比较确定HY-1、HY-2和HY-4三菌株作为研究对象,经鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）的不同菌株,三菌株在Genbank上的登录号分别为：eu915687、eu915686和eu915688。在甲基对硫磷质量浓度为50mg·L-1时,三菌株72h的降解率分别为91．7％、87．7％与92．4％．降解率无显著性差异（P〉0．05）,当甲基对硫磷质量浓度增加到100mg·L-1时,三菌株对甲基对硫磷的降解率有所下降,其中HY-2对甲基对硫磷的降解率下降最大达23％,且和其他两菌株有显著性差异（P〈0．05o三菌株72h对100mg·L-1毒死蜱的降解率分别达到64．8％、53．7％和56．5％,在不同的毒死蜱初始质量浓度下,HY-1和HY-4两菌株对毒死蜱的降解率无显著性差异（P〉0．05）,HY-2与HY-1、HY-4两菌株有显著性差异（P〈0．05o三菌株对三唑磷的降解率均较低,其中HY-2对初始质量浓度为100mg·L-1三唑磷的降解率最高仅为20．7％,其余两菌株对三唑磷的降解率比HY-2低且无显著性差异（P〉0．05o可以得出本研究分离得到的蜡状芽孢杆菌不同菌株对有机磷农药的降解存在多态性。     

高效纤维素降解菌分离筛选、复合菌系构建及秸秆降解效果分析

从川西高原贡嘎山区杜鹃林下土壤中分离纤维素降解菌,构建具有高效降解纤维素能力的复合菌系,并对秸秆降解效果进行分析,为农业废弃物的循环利用提供菌种资源和理论依据.样品及经风干、高温等预处理后,采用平板涂布法进行分离,共获得79株菌株;通过刚果红实验对分离获得的菌株进行初步筛选,运用DNS法测定各菌株的羧甲基纤维素酶活(Carboxymethyl cellulase,CMCase),复筛得到15株具有CMCase活能力的菌株.经滤纸条崩解实验、秸秆崩解实验及降解率测定,最终确定了各菌株的纤维素降解能力,进一步经拮抗实验,选取相互无拮抗的菌株构建5个复合菌系:A(112、146、156、171),B(145、147、150、153),C(110、116、174),D(147、154、171),E(145、146、150、152、153).复合菌系的滤纸酶活(Fpase)与秸秆降解率测定结果显示,组合C对秸秆的降解率较单菌株116提高了50.71%,组合D对秸秆的降解率较单菌株154提高了41.54%.经形态学和分子生物学鉴定,纤维素降解能力比较好的两个组合中的菌株分别被鉴定为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)以及链霉菌属(Streptomyces sp.).本研究表明,复合菌系纤维素降解能力优于单一菌株,C、D两组复合菌系表现出较高的纤维素降解能力,具有进一步开发的价值.     

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)工程菌株田间残留和扩散的追踪检测

分别在北京和江苏省连云港市对携带Btcry基因的荧光假单胞菌工程菌进行了田间残留与扩散的追踪检测 .对越冬前后的试验地和保护地土壤样品进行抗生素抗性平板分离 ,能检测到极少量的具有与出发菌株相同抗性的荧光假单胞菌菌落 ,但没有发现工程菌株的残留与扩散 .对江苏试验地样品还进行了工程菌株质粒卡那霉素和壮观霉素抗性标记基因的抗性菌落分离 ,绝大多数样品中都能分离到包括荧光假单胞菌在内的抗性菌落 ,土样中菌密度n(cfu) =10 4 ～ 10 5g-1,但进行Btcry基因PCR -RFLP检测时没有从样品中得到特异扩增产物 .研究结果表明 :工程菌株抗性标记基因在自然界广泛存在 ,工程菌在株环境中没有残留和扩散 ,具有良好的生物安全性 .表 4参 8     

病死猪堆肥高效降解复合菌系的构建及应用效果

为了缩短堆肥时间、提高堆肥产品质量,从病死猪好氧堆肥样品中筛选能高效降解蛋白质和脂肪的安全菌株,经拮抗验证后构建出病死猪堆肥高效降解复合菌系并进行现场堆肥试验.结果显示通过分离纯化共获得36株具有尸体降解能力的安全菌株,经酶活性测定复筛出10株具有较高蛋白酶及脂肪酶活性的菌株,对其进行菌种鉴定及菌株间拮抗研究后,混合构建为5组复合菌系,分别为A、B、C、D和E.通过比较复合菌系的蛋白酶及脂肪酶活性大小,进一步选择优选复合菌系E进行现场堆肥试验,结果表明堆肥期间对照组和接菌各组(2%和4%)最高温度分别达到约56.3、60.8和61.2℃;低剂量和高剂量接菌组堆肥温度达到55.0℃以上的高温天数均持续约7 d,显著高于对照组的3 d(P 0.01);堆肥结束时,对照组和接菌各组(2%和4%)降解率分别达到78.7%、97.7%和98.0%.本研究构建的复合菌系E可有效提高堆肥温度并延长高温维持时间,加速病死猪的降解.(图5表2参30)     

降解植物甾醇为甾体9α-OH-AD菌株的筛选与鉴定

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是重要的甾体药物中间体,多用于生产糖皮质激素类药物.通过微生物法转化植物甾醇生成9α-OH-AD,将为工业化生产提供极大便利.从榨油厂、油菜花田等多处土壤中筛选出1株高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的菌株,根据16S r DNA序列比对并结合菌株的形态特征、生理生化特征分析,鉴定其为分枝杆菌属,并将其命名为Mycobacterium sp.LY-1.该菌在往复式摇床中培养,当培养条件为温度30℃、转速120 r/min、转化时间7 d、底物添加浓度为5 g/L时,9α-OH-AD产物得率达到16.2%.为解决底物植物甾醇在水中溶解性较差的问题,考察了助溶剂(吐温80、β-环糊精)对植物甾醇转化产甾药中间体9α-OH-AD效率的影响.经过筛选,最终确定最适助溶剂为0.1%的吐温80.在此条件下,当底物投料浓度为15 g/L时,9α-OH-AD的浓度达到3.9 g/L,产物摩尔得率提高至35.1%.本研究表明菌株LY-1转化效率好,可为后续的代谢工程改造提供便利并为后期用于工业化生产奠定基础.     

非离子表面活性剂强化白腐菌及其粗酶液对有机氯农药的降解

有机氯农药曾在世界范围内被广泛用于农业害虫的防治,为利用表面活性剂增效修复技术去除环境中的有机氯农药污染,研究了3种非离子表面活性剂(Tween 80、Tween 20和Triton X-100)对4种典型有机氯农药(4,4’-DDT、狄氏剂、艾氏剂和七氯)在水相中的增溶作用,对白腐菌Phlebia acanthocystis TMIC34875生长的影响以及对该菌株、胞外及胞内酶降解有机氯农药的强化效果.增溶试验结果表明,3种非离子表面活性剂可明显增加各有机氯农药的水溶解度,其增溶能力大小顺序为Tween 80>Tween 20>Triton X-100.Tween 80在低浓度(0.05、0.1和0.2 gL-1)下会促进白腐菌在PDB培养基中的生长,使其生物量增加;而高浓度(0.5和1.0 gL-1)的Tween 80则对菌株的生长产生一定的抑制作用.在0.05-0.5 g L-1浓度范围内,Tween 80可强化菌株对有机氯农药的降解效果,且降解率随着Tween 80浓度的增加而增加.降解强化效果在Tween 80浓度为0.5 gL-1时达到最佳,4,4’-DDT、狄氏剂、艾氏剂和七氯的降解率相比对照分别提高了6.70%、6.37%、10.94%和7.21%.Tween 80同样可促进胞内酶和胞外酶对4种有机氯农药的降解,尤其是对胞外酶降解的强化作用,在1.0 gL-1的Tween 80溶液中,有机氯农药的降解率提高了10%左右.可见,在农药污染环境的生物修复技术中,应用Tween 80等非离子表面活性剂来提高修复效率是可行的.     

城镇居住体系的构建--以昆山市为例

首先阐述了目前我国城镇住区所面临的几个主要问题,针对这些问题提出了城镇居住体系构建内容及其原则,并且以昆山市城镇居住体系构建为例,划分了昆山市主要居住片区并对其做了适宜度分析,同时提出各片区社区的设计及指标体系,探索昆山市和谐发展的住区环境,寻求一个健康、可持续发展的人居环境道路。     

以科学发展观为指导 努力构建和谐高校印刷企业

构建和谐社会是落实科学发展观的基本内容，创建和谐企业是构建和谐社会的重要支撑．本文论述了企业在科学发展观指导下，要努力建立企业与员工和谐的劳动关系，以及以科学发展观构建和谐企业的基本途径．参5．     

罗尔斯顿菌(Ralstonia sp.)T6对三氯吡啶醇污染土壤的修复及能完全矿化毒死蜱工程菌株的构建

以毒死蜱降解中间代谢产物3,5,6-三氯-2-吡啶醇(TCP)高效降解菌罗尔斯顿菌(Ralstonia sp.)T6为材料,研究其在土壤中对TCP的降解特性。结果表明,温度、接菌量和初始底物浓度对TCP的降解都有影响,T6菌株降解TCP的最适温度为30℃,当土壤含菌量〔以菌落形成单位(CFU)计〕小于10×108kg-1时,降解率随着含菌量的增加而提高,当含菌量超过10×108kg-1时,降解率不再提高。降解率随着TCP初始浓度的增加而降低,当TCP初始浓度为50~100 mg·kg-1时,6 d内可将50 mg·kg-1TCP降解80%。利用基因工程手段,将来源于寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)DSP-1的甲基对硫磷水解酶基因(mpd)插入菌株T6基因组16S rRNA基因中,成功构建一株可彻底矿化毒死蜱的重组工程菌株T6-mpd。生长试验结果表明罗尔斯顿菌T6-mpd和T6的生长特性基本一致。对T6-mpd菌株降解毒死蜱的特性研究结果表明,在LB培养基中,T6-mpd对毒死蜱的水解效率与DSP-1基本一致,但在基础盐(MSM)培养基中,T6-mpd在60 h内对50 mg·L-1毒死蜱的降解率仅为36%,显著低于DSP-1。模拟土壤原位修复试验结果表明,在含菌量为108kg-1条件下,T6-mpd在2 d内可将50mg·kg-1毒死蜱降解64%。认为T6-mpd菌株在毒死蜱残留污染环境修复中具有潜在的应用前景。     

区域农田畜禽承载量预测模型构建与应用:以赤峰市为例

为对区域现有生猪养殖数量的合理性进行评价及对生猪养殖承载量进行预测,从畜禽养殖-耕地-作物系统出发,基于农田养分平衡理论及有机和无机肥合理配施方法,构建区域农田畜禽承载量预测模型。以赤峰市为例,设定有机和无机肥配施比例为5∶5,并保持现有农田N或P2O5养分盈余量不变,分别基于N和P2O5养分盈余量不变实地应用该模型。结果表明,基于N时可新增生猪养殖数量43.6万头,承载量为630.8万头;基于P2O5时可新增生猪养殖数量369.3万头,承载量为1 041.3万头。位于西拉木伦河南岸的松山区、翁牛特旗、喀喇沁旗、宁城县和敖汉旗是可新增生猪养殖的主要区域。从环境压力角度考虑,推荐基于N的预测值作为计算赤峰市可新增生猪养殖量和承载量的依据。     

珠江三角洲典型区域蔬菜地土壤中有机氯农药的污染特征——以东莞市为例

近年来珠江三角洲经济迅速发展的同时所带来的土壤有机氯农药污染问题备受关注,着重调查研究了东莞蔬菜地土壤中17种有机氯农药的污染特征.2002年10-12月采集蔬菜地土壤样品37个,利用气相色谱分析有机氯农药的含量.研究结果表明,东莞蔬菜地土壤样品中均检出有机氯,其中DDE与艾氏剂的检出率为100.0%;17种有机氯农药总含量(∑17OCPs)范围为2.47～82.23 ng·g-1,均值为22.53 ng·g-1.含有7个Cl取代基的有机氯农药即七氯与环氧七氯的含量均显著低于其他有机氯农药的含量;尽管东莞市蔬菜地土壤中DDTs的含量明显低于省内外其他地区蔬菜地土壤DDTs含量,但东莞蔬菜地土壤中有机氯农药主要以毒性较强的六氯代有机化合物为主,因此东莞蔬菜地土壤中有机氯农药污染状况不容忽视.