大熊猫肠道噬菌体的多样性

噬菌体在维持宿主肠道微环境中起着重要作用.运用宏基因组学方法全面探究大熊猫肠道噬菌体的多样性.共注释到548种噬菌体,主要来自11个科38个属548个种.大多数噬菌体主要来自长尾病毒科Siphoviridae、肌尾噬菌体科Myoviridae和短尾噬菌体科Podoviridae,所占比例分别为41.7%、27.6%和19.5%.其中未分类到科的噬菌体占10.5%.38个属主要为λ样病毒属(10.3%)、T4样病毒属(8.0%)、P1样病毒属(7.1%)、Phieco32样病毒属(5.3%)、T5样噬菌体属(3.4%)等. 548个噬菌体中有22种丰度超过了1%,主要为肠细菌噬菌体P1(7.0%)、链球菌噬菌体LYGO9(6.1%)、肠细菌噬菌体λ(5.3%)、肠细菌噬菌体Phieco32(5.2%)、链球菌噬菌体phi30c(3.8%)等.此外,不同大熊猫繁育基地之间噬菌体群落结构存在显著差异(科水平:R=0.168,P 0.01;属水平:R=0.128,P 0.01;种水平:R=0.291,P 0.01),在α多样性指数方面SSP基地的Chao1指数与其他两个基地之间存在着显著差异.本研究发现大熊猫肠道噬菌体种群丰富多样,且因生境不同而显著变化;结果有助于挖掘大熊猫肠道噬菌体在疾病防控及治疗的潜力,为保障大熊猫的肠道健康提供新的思路.(图17表2参34)     

一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化

从腐烂的苹果表皮筛选到一株碱性果胶酶的高产菌株,命名为WSHB04-02.分离菌株为革兰氏阳性细菌,有芽孢,菌落颜色为乳白色.分离菌株WSHB04-02的16SrDNA全序列分析表明,该菌株与Bacillussubtilus具有99%的相似性,并与其他13株产碱性果胶酶菌株的16SrDNA结果进行同源性分析,并构建系统发育树.发现菌株WSHB04-02在不含果胶类物质与Mg2 的培养基上能高产碱性果胶酶,在优化的培养条件下,碱性果胶酶的酶活达到34U/mL,在国内还未见报道.图6表2参15     

秸秆污泥堆肥产纤维素酶细菌的筛选及产酶条件优化

从添加秸秆进行堆肥处理的污泥中采集样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出具有纤维素降解能力的细菌,再通过酶活力测定从中分离筛选出1株相对高活性的产纤维素酶细菌CI;通过基于16S rRNA基因序列的系统发育分析,初步确定该菌株为Devosia sp..利用单因素试验对目的菌株C1进行产纤维素酶发酵条件优化,结果表明菌株C1产纤维素酶的最佳发酵时间、培养温度、摇床转速以及最适初始pH值分别为60 h、30℃、130 r·min^-1和7.2～7.5,且在该条件下其滤纸酶（FPase）和羧甲基纤维素酶（CMCase）活力分别达23.10和54.97 U·mL^-1.     

木质素降解真菌的筛选及产酶特性

通过定性、定量系列实验从土壤中筛选到5株有木质素降解能力的低等真菌，经鉴定属于青霉属、镰刀霉属、曲霉属和木霉属，其中青霉属和镰刀霉属是土壤中木质素转化的主要作用者．降解能力最强的简青霉Penicillium simflitcissimum H5培养13d可降解Kraft木质素40．26％，产酶研究发现，该菌分泌胞外木质素过氧化物酶和漆酶，其中前者主要在培养前期产生，后者在整个培养过程中均有较好的活性．图4表1参14.     

一株嗜酸性产纤维素酶真菌的特性及产酶条件优化

从四川海螺沟原始森林腐土中分离到一株嗜酸性产纤维素酶的真菌X-13,其主要特点是产纤维素酶的最适pH及其纤维素酶最适反应pH均为2.0.在PDA培养基上培养时菌落呈浅黄色至肉桂色,反面呈黄色至棕褐色,产黄色色素;菌丝体透明有隔膜,分生孢子呈球形或近球形.根据菌株的形态特征以及ITS序列同源性和系统发育分析结果,鉴定该菌株为土曲霉(Aspergillus terreus Thom).该菌最佳产酶培养时间为8～10 d;最适产酶温度为30℃,纤维素酶最适反应温度为50℃;最佳碳源、氮源分别为纤维素粉和硫酸铵.通过响应面法对菌株产纤维素酶条件进行优化,使菌株X-13纤维素酶活从1.39 IU/mL提高到2.94 IU/mL,提高了111.5%.     

镇江香醋醋酸发酵阶段产乳酸功能细菌的物种多样性

乳酸是传统食醋中主要的不挥发性有机酸,具有柔和食醋酸感、增强风味品质等作用,但是目前对于醋酸发酵过程中乳酸形成的微生物机理尚缺少深入研究.首先分析了镇江香醋醋醅中D-乳酸和L-乳酸含量;继而采用宏基因组和宏转录组测序分析了醋醅中L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和D-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因的相对表达水平;最后利用兼并引物扩增和扩增子测序方法分析了L-LDH和D-LDH基因的物种多样性.结果表明,参与L-LDH和D-LDH合成的微生物均主要分布在Lactobacillus,其相对丰度均占到80%以上;其中与D-LDH相关的微生物主要为Lactobacillus reuteri(67.9%),Lactobacilluspontis(10.2%),Lactobacillusfermentum(4.1%),Lactobacillushelveticus(1.3%),而与L-LDH相关的微生物主要为Lactobacillus helveticus(70.3%),Lactococcus lactis(9.2%),Lactobacillus pontis(8.0%),Lactobacilluscasei(1.3%).因此,镇江香醋醋酸发酵阶段乳酸主要由Lactobacillus菌群代谢丙酮酸产生,但D-乳酸和L-乳酸的产量则受到具体菌株的调控,其中D-乳酸可能主要由L. reuteri产生,L-乳酸可能主要由Lactobacillus helveticus产生.本研究结果可为解析醋酸发酵过程中乳酸的生物合成途径提供理论基础.(图7表1参30)     

若尔盖高原湿地纤维素降解菌组成及产酶特性

以青藏高原湿地若尔盖地区不同生境土壤为材料,通过富集,计算降解圈个数,分析该地区纤维素降解菌的含量.分离得到15株具有纤维素降解能力的菌株,从中复筛得到一株降解能力较强的菌株3C-6.12,经16S rRNA和Biolog鉴定为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris).该菌株在以质量比例3:2的麸皮与玉米芯为发酵培养基时,酶活最高为66.44U/mL,最适pH值为6～8,最佳生长温度为30℃.该菌株的成功选育为后续高效、充分利用纤维素类物质生产生物能源提供了很好的菌种来源.     

干扰素废水菌种的筛选与产酶特性

针对干扰素废水具有抑制性导致活性污泥驯化培养难的问题,利用稀释涂布、富集培养的方法从干扰素废水中筛选出5株高效菌株,分别为IFN1~IFN5。观察5株高效菌种的菌落形态,经16S rDNA测序鉴定其中2株菌株为假单胞菌,2株菌株为索氏菌,1株为不动杆菌。完成了5株高效菌种的生理生化实验,分析其酶代谢系统:IFN1可产生蛋白酶和色氨酸酶;IFN2可产生过氧化氢酶、色氨酸酶和蛋白酶;IFN3可产生过氧化氢酶、色氨酸酶、蛋白酶和淀粉水解酶;IFN4可产生过氧化氢酶、蛋白酶和淀粉水解酶;IFN5可产生过氧化氢酶、蛋白酶。本研究为后续针对降解干扰素废水诱导酶的提取奠定基础。     

一株大熊猫肠道厌氧纤维素菌的分离鉴定、系统发育分析及生物学特性的研究

从成都动物园健康大熊猫的肠道采集样品,富集分离获得一株典型的厌氧纤维素分解菌PD.分离菌是杆状,革兰氏阳性(G ),菌体大小为0.5μm×(3～5)μm,严格厌氧;生长温度为25～40℃,最适生长温度为38℃;pH范围5.0～9.0,最适pH7.2;在纤维素粉作碳源的琼脂培养基上菌落直径为1～3mm,白色透明斑;分离菌株不仅能利用纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、松三糖、覃糖等多种可溶性碳源,而且可以利用纤维素粉等不溶性碳源.同时,对菌株PD进行了16SrDNA的PCR扩增,并对扩增产物测序.对16SrDNA部分序列进行了分析,并构建了系统发育树,表明菌株PD属于梭菌属,与Clostridiumlentocellum(T)的16SrDNA序列具有92.2%相似性.图5表1参18     

一株耐冷菌所产降解酶的特性及应用

从我国寒冷地区筛选到一株能产低温降解酶的菌株.细菌学形态及16S rDNA鉴定表明,该菌株属希瓦氏菌属(Shewanella),最适生长温度为5～15℃,属耐冷菌,并暂命名为Shewanella sp.J5.菌株J5分泌的降解酶中蛋白酶和淀粉酶所表现的活力较高,在0℃下分别仍能保持20%和40%的酶活性,最适温度分别为40℃和30℃,最适pH分别为8.0和7.0～10.0,且对热敏感,属于碱性低温酶;金属离子中Mn2+、Fe2+对蛋白酶有明显的促进作用,而淀粉酶对金属依赖性较小;HPSEC结果表明,低温蛋白酶在水解酪蛋白过程中,对相对分子质量10 000的大分子肽水解能力很强.脱氢酶酶活测定结果表明,低温下菌株活性显著高于常温活性污泥,5℃下,添加菌株J5到活性污泥中可使废水COD去除率提高33%.因此,该菌株在低温污水处理上具有一定的应用前景.     

不同酸碱条件下光合细菌的生长产氢特性

为了解光合细菌的产氢机理,对沼泽红假单胞光合产氢菌CQK-01在光生物平板反应器中进行序批次培养,以470 nm LED灯提供连续光照,葡萄糖为碳源底物,研究不同初始酸碱条件下产氢光合细菌的生长特性、产氢特性以及能量转化效率.结果表明,在弱碱性条件下最适宜产氢光合细菌的生长;在反应液为酸性条件下,光合细菌具有较高的产氢量、产氢速率和能量转化效率,然而产氢纯度随着初始pH值的增大而升高;在温度30℃、光照强度1 000lx、底物浓度75 mmol/L的实验条件下,光合细菌的最佳产氢pH值为7.0,实验中最大累积产氢量为8.0 mmol,最大产氢速率为3.39 mmol g-1(cell dry weight)h-1,产氢纯度高达70%,底物能量转化效率最大为1.98%,光能转化效率最大为7.7%.     

卧龙自然保护区大熊猫栖息地植物群落多样性Ⅴ：不同竹林的物种多样性

采用α-多样性、β-多样性和植物区系等参数,分析了卧龙自然保护区野生大熊猫栖息地主食竹种各竹林的物种多样性特征. 结果表明,物种丰富度、物种优势度、物种均匀度和植物区系成分在3种竹林中都有着显著性差异（P〈0.05）. 物种丰富度和优势度的排序是拐棍竹林〉冷箭竹林〉短锥玉山竹林;Shannon-Wiener多样性指数呈现出拐棍竹林〉短锥玉山竹林〉冷箭竹林的变化格局;Simpson多样性指数为冷箭竹林大于拐棍竹林和短锥玉山竹林,而拐棍竹林与短锥玉山竹林相差不大;群落均匀度两指数（Jsw和Jsi）均表现为短锥玉山竹林〉拐棍竹林〉冷箭竹林. 不同竹林各层次的α-多样性,无论是乔木层、灌木层,还是草本植物层,在3种竹林之间均具有不同的变化. 拐棍竹林、冷箭竹林和短锥玉山竹林的植物科属地理分布格局较为相似（P〉0.05）,都以温带地理成分为主,具有与卧龙自然保护区整体植物区系地理成分的相同模式,但就植物种类而言,3种竹林的差异极其显著（P〈0.05）;同时,各竹林中乔木层优势树木的重要值、灌木层植物的平均数量,以及草本层植物的平均盖度之间也具有明显的差异（P〈0.05）. 3种竹林之间的相似性系数（β-多样性）很低,具有各自的组成物种和群落结构（P〈0.05）,这与不同竹种的生物学特性、海拔分布范围和生长发育阶段密切相关. 本研究结果可为竹林分布的制图、退化生境的恢复、地震灾害受损栖息地的重建以及圈养大熊猫食物基地的建设等提供参考资料. 图3 表5 参32     

卧龙自然保护区大熊猫栖息地植物群落多样性V:不同竹林的物种多样性

采用α-多样性、β-多样性和植物区系等参数,分析了卧龙自然保护区野生大熊猫栖息地主食竹种各竹林的物种多样性特征.结果表明,物种丰富度、物种优势度、物种均匀度和植物区系成分在3种竹林中都有着显著性差异(P＜0.05).物种丰富度和优势度的排序是拐棍竹林＞冷箭竹林＞短锥玉山竹林;Shannon-Wiener多样性指数呈现出拐棍竹林＞短锥玉山竹林＞冷箭竹林的变化格局;Simpson多样性指数为冷箭竹林大于拐棍竹林和短锥玉山竹林,而拐棍竹林与短锥玉山竹林相差不大;群落均匀度两指数(Jsw和Jsi)均表现为短锥玉山竹林＞拐棍竹林＞冷箭竹林.不同竹林各层次的α-多样性.无论是乔木层、灌木层,还是草本植物层,在3种竹林之间均具有不同的变化.拐棍竹林、冷箭竹林和短锥玉山竹林的植物科属地理分布格局较为相似(P＞0.05),都以温带地理成分为主,具有与卧龙自然保护区整体植物区系地理成分的相同模式,但就植物种类而言,3种竹林的差异极其显著(P＜0.05);同时,各竹林中乔木层优势树木的重要值、灌木层植物的平均数量,以及草本层植物的平均盖度之间也具有明显的差异(P＜0.05).3种竹林之间的相似性系数(β-多样性)很低,具有各自的组成物种和群落结构(P＜0.05),这与不同竹种的生物学特性、海拔分布范围和生长发育阶段密切相关.本研究结果可为竹林分布的制图、退化生境的恢复、地震灾害受损柄息地的重建以及圈养大熊猫食物基地的建设等提供参考资料.图3表5参32     

幼年大熊猫断奶前后肠道微生物与血清生化及代谢物的变化

采集3只幼年大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)在断奶前后15 d的粪便(N=24)和血清样品(N=24),基于高通量测序技术、生化和液相色谱-质谱检测,对其肠道菌群、血清生化指标和代谢物质的组成变化进行研究.结果显示,断奶后大熊猫肠道菌群丰富度下降,肠道内细菌由Firmicutes变为Proteobacteria为主要门.在细菌属水平,Escherichia-Shigella、Streptococcus、Clostridium、Enterococcus和Lactobacillus的相对丰度显著下降,但Pseudomonas、Leuconostoc和Sphingobacterium则上升(LDA4).肠道真菌由Ascomycota和Basidiomycota变为Basidiomycota和Zygomycota为主要门.在真菌属水平,Microidium的相对丰度显著下降,但Cystofilobasidium、Guehomyces和Cryptococcus显著上升(P 0.05).此外肌酸激酶和乳酸脱氢酶断奶后显著下降,而总胆红素则上升(P 0.05).断奶前后发现有54个(正模式)和46个(负模式)显著性差异代谢物(P 0.05),如Heme和Allantoic acid等,这些差异物质和肌酸激酶和乳酸脱氢酶有显著相关性(P 0.05).本研究表明断奶后大熊猫肠道中高丰度的纤维素或半纤维素降解菌种类增加,为研究大熊猫肠道微生物对竹子的利用提供数据支撑;肌酸激酶、乳酸脱氢酶和总胆红素可作为大熊猫断奶时健康状况的备选标志生理指标,有助于大熊猫断奶过程中健康状态的维护.(图6表3参43)     

不同生境产脂肪酶菌株的筛选及多样性

为发掘不同特性脂肪酶微生物资源,采用纯培养方法从青海高寒草地、雅安山区、成都平原分离得到产脂肪酶菌株54株.通过对菌株的DNA进行ERIC-PCR指纹图谱分析,按聚类树划分为5个操作分类单元.16S rDNA序列测定和聚类分析显示,分离菌株分布于芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobacter).多样性分析表明,与青海高寒草地、雅安山区相比,成都平原产脂肪酶菌株遗传多样性更为丰富.在54株菌中都出现了300 bp和1 300 bp两个特异且稳定出现的条带,这两个特异条带可能是产脂肪酶菌株的SCAR标记条带.     

产碱杆菌DN25中降氰酶的分离纯化及生化特性

以一株可降氰的产碱杆菌DN25为酶来源,通过超滤、30 mg/mL硫酸鱼精蛋白沉淀、30%～70%硫酸铵盐析和Phenyl-Toyopearl 650M疏水层析等步骤,获得比活力为44 U/mg的纯化酶制剂.在确定酶浓度、反应时间等氰降解活力测定条件后开展酶学性质研究,试图为将来氰降解代谢机理的深入研究和菌株的基因工程改造提供理论基础.研究结果表明,此纯化酶催化氰化物水解的最适pH值为8.0,最适温度为30℃.该酶在pH 7.0～8.0区域稳定,而在pH>9时会很快失活;在30℃保存10 h,酶活力保持稳定,高于60℃,酶快速失活.加入甘氨酸稳定剂,在60℃下保存20 min酶活仍可保留19.6%.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.11 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.23 mmolL-1min-1.     

高产木聚糖酶细菌的筛选、鉴定及其部分酶学特性

细菌木聚糖酶具有优良的酶学特性,发掘和研究高产菌株资源对促进木聚糖酶工业生产具有十分重要的意义.采用刚果红透明圈法从采集的土样样品中筛选分离得到1株高产细菌木聚糖酶的菌株SD4-4,通过形态特征及16S r DNA序列分析进行鉴定,并以本实验室保存的细菌木聚糖酶工业生产用菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SL作为对照,对比研究SD4-4的产酶水平及酶学性质.结果表明,SD4-4为短小芽孢杆菌(B.pumilus),利用小麦麸皮摇瓶发酵,其上清酶活可达1 166.0 U/m L,而SL上清酶活为281.0 U/m L.SD4-4所产木聚糖酶作用最适温度约为50℃,最适p H约为5.0.粗酶液在30-50℃的环境下处理10 min,相对酶活均保持在90%以上;在p H 4.0的条件下处理30 min,相对酶活仍有76%,酸性环境下稳定性较好.因此,菌株SD4-4产酶水平高于对照菌株SL,酶学特性更为优良,工业应用前景良好,尤其在饲料添加剂行业具有较大的开发潜力.     

亚成体大熊猫肠道微生物结构的季节差异及其与肠道纤维素酶活性的相关性

大熊猫以低营养高纤维的竹子作为主要食物来源,但其消化系统结构保留了肉食动物的特点,不具备消化纤维素的能力,因此肠道菌群对其消化纤维素具有重要意义.为了解不同季节亚成体大熊猫肠道微生物结构的变化及其与肠道纤维素消化能力的内在联系,通过高通量测序技术分析4只亚成体大熊猫肠道细菌和真菌多样性的季节差异,并检测不同季节的肠道纤维素酶活性.结果发现不同季节亚成体大熊猫肠道细菌、真菌结构和丰富度存在较大差异.复杂的肠道微生物组成,特别是优势细菌结构主要决定了亚成体大熊猫消化利用纤维素的能力.冬季(2月)肠道微生物结构较复杂,微生物丰富度也相对较高,细菌的优势度高于其他季节.秋季(11月)和冬季(2月),亚成体大熊猫的纤维素酶活性较高,冬季纤维素酶活性约为其他季节的5倍.亚成体大熊猫的纤维素酶活与其肠道优势细菌Streptococcus丰度的季节变化具有相似的趋势,相关性系数为0.582,是大熊猫分解利用纤维素的重要贡献者.因此,亚成体大熊猫不同季节的肠道微生物结构演变对其纤维素消化具有重要影响.(图3表6参28)     

钻井废弃液中石油污染物及细菌生态多样性

采用GC/MS分析方法,发现平湖油田钻井废弃液中含有烃类、酸类和酯类等23种有机污染物质,含量达到49 800 mg/L。运用16S rRNA基因分析法测得的微生物生态多样性表明,废弃液中微生物种类丰富,包括γ和β变形杆菌,γ-Proteobacteria是优势菌群,占克隆总数78.6%。Oceanospirillales、Pseudomonadales和Enterobacteriales是γ-Proteobacteria纲的主要菌群。     

海洋细菌B3B产河豚毒素特性的鉴定及其发酵培养基优化

从我国渤海红鳍东方豚(Fugu rubripes)的卵巢中分离到了一株海洋细菌B3B,对其发酵产物进行了分离和精制,通过小鼠试验、高效液相色谱试验及质谱分析,认定其发酵产物中含有河豚毒素(tetrodotoxin,TTX).采用均匀设计回归分析及优化系统对其培养基组分做了优化,获得了较理想的发酵培养基,使TTX的产量提高了128.7%.图2表2参21