人工微宇宙环境下油气指示微生物的异常特征

为了解烃类对微生物的作用机制,通过人工微宇宙装置进行实验室水平模拟,结合培养法和分子生物学检测技术,以典型含油气区块土壤样品中的油气指示微生物为研究对象,探讨在模拟微渗漏条件下,一定驯化周期内不同轻烃组分驯化下油气指示微生物的数量变化和群落结构演替特征.结果显示,在微量轻烃(1×10~(-8))持续驯化下,土壤中油气指示微生物数量发生了不同程度的增长,甲烷驯化组中甲烷氧化菌的菌落数量增长了76.5%,pmo A基因丰度增幅达180.0%;丁烷驯化组中丁烷氧化菌的菌落数量增长了212.0%,bmo X基因丰度增幅达285.0%.16S rRNA高通量测序进一步显示,在模拟微渗漏(1×10~(-8))的条件下,油气指示微生物属于低丰度种群,其中Methylococcaceae(甲基球菌)、Methylophilaceae(嗜甲基菌)、Methylocystis(甲基孢囊菌)等微生物与甲烷正相关,Rhodosprillaceae(红螺菌)、Pseudonocardia(伪诺卡式菌)等微生物与丁烷正相关,其他的一些硝化微生物Nitrospira(硝化螺旋菌)、Xanthomonas(黄单胞菌)等则与烃类负相关.本研究深化了关于气态烃对油气微生物作用机制的认识,可为油气微生物勘探技术提供新思路.(图6表2参33)     

准好氧填埋场垃圾样品中甲烷氧化菌的群落多样性分析

为了探讨准好氧垃圾填埋场中的甲烷氧化机理,本研究利用RealTime-PCR和PCR-DGGE技术对其中的甲烷氧化菌分别进行了定量分析和群落多样性分析。研究结果表明,PCR-DGGE技术可以用于垃圾样品中甲烷氧化菌的微生物多样性分析;在距导气管0、2.5、5.0、10.0和15.0 m处垃圾样品中甲烷氧化菌的数量分别为1.13×109、2.22×108、2.38×108、2.20×107和5.21×106g-1,呈现逐渐降低的趋势;垃圾样品中甲烷氧化菌的丰富度和香侬多样性指数依次为：0 m〉2.5 m〉5.0 m=10.0m〉15.0 m,此外,垃圾样品中甲烷氧化菌可归为：Methylocaldum（甲基暖菌属）、Methylobacterium（甲基杆菌属）和Methylocystis（甲基孢囊菌属）,且优势菌种为Type I型Methylocaldum。     

炼油厂周边PAHs污染土壤中微生物群落结构多样性研究

直接从污染土壤中提取微生物基因组DNA,对基因组DNA进行16S rDNA聚合酶链式反应（PCR）扩增和末端限制性片段多态性（T-RFLP）分析,进而对炼油厂附近PAHs污染区土壤微生物群落结构和多样性进行初步研究。结果表明,PAHs浓度较高的土壤中PAHs主要以高相对分子质量PAHs为主,此外,其土壤微生物群落多样性明显低于PAHs浓度较低的土壤。高浓度PAHs刺激了某些土壤微生物生长。不同污染程度的土壤存在一定数量相同的优势菌群,但相对丰度具有明显差异。其中α-变形菌是五个区域土壤中的主导微生物。研究结果将为炼油厂周边土壤的修复治理提供科学依据。     

高寒湿地甲烷氧化菌群落对模拟增温的响应

甲烷氧化菌能够氧化湿地生态系统产生的绝大部分甲烷,从而减缓温室效应.高寒湿地对气候变化极为敏感,但目前高寒湿地甲烷氧化菌群落对温度升高如何响应的相关研究较少.以青海湖高寒湿地为研究对象,利用开顶箱（open-top chamber,OTC）模拟增温实验,进一步通过高通量测序来探究温度升高后高寒湿地甲烷氧化菌群落结构及多样性的变化.结果显示,高寒湿地甲烷氧化菌群落的优势菌门为变形菌门;温度升高对高寒湿地甲烷氧化菌群落的多样性指数没有显著影响,但对甲烷氧化菌的群落结构作用显著. LEfSe分析表明,增温处理组与自然对照组共存在29个差异菌群,温度升高降低了属水平优势菌群的相对丰度.增温显著改变了3个优势菌属的相对丰度,甲基球菌属、甲基杆菌属的相对丰度显著降低,甲基弯曲菌属的相对丰度显著升高.高寒湿地甲烷氧化菌群落功能基团为21个,大多与碳、氮代谢过程密切相关.整体而言,对比高寒湿地甲烷氧化菌的群落多样性,其群落结构对温度升高更为敏感,部分菌群的相对丰度发生了显著变化.（图8参44）     

微生物法在油气勘探中的应用研究

石油天然气的微生物勘探法是通过测定土壤中以微渗漏轻烃为食物来源的微生物菌落来圈定烃类渗漏的范围.本文探讨了甲烷氧化菌、厌氧纤维素分解菌和硫酸盐还原菌在油气勘探中的意义,并将其作为指示微生物,以川西孝泉地区已知天然气田为例,对微生物油气勘查技术的试验效果进行研究.结果发现,在气田上方指示微生物存在明显异常现象,即在气田上方甲烷氧化菌、厌氧纤维素分解菌数量较少,硫酸菌还原菌较高;气田外缘甲烷氧化菌、厌氧纤维素分解菌数量较高,而硫酸菌还原菌较低.研究表明,微生物地表油气勘探技术用于油气预测是有效的.图2参12     

间隙灌溉和控释肥施用耦合措施对稻麦轮作系统土壤微生物群落丰度的影响

间隙灌溉模式下控释肥施用可减缓稻麦轮作系统CH_4和N_2O排放交互排放效应,从而降低综合温室效应,然而有关间隙灌溉和控释肥施用耦合措施对稻麦轮作系统土壤微生物的影响鲜有研究。通过采集稻麦轮作系统田间原位试验新鲜土样,采用核酸定量技术研究间隙灌溉和控释肥施用耦合措施下稻麦轮作系统土壤微生物群落丰度的变化,以探讨此耦合措施降低稻麦轮作系统降低CH_4和N_2O排放的微生物机理。结果发现,除古菌外,稻季土壤细菌、产甲烷菌、甲烷氧化菌、氨氧化菌和反硝化菌群落丰度均高于麦季;间隙灌溉显著影响稻田产甲烷菌、甲烷氧化菌、氨氧化菌和反硝化菌数量的季节变化;与尿素相比,施用控释肥增加了稻麦轮作系统细菌、古菌和产甲烷菌数量,降低了甲烷氧化菌、氨氧化菌、反硝化菌数量。稻季CH_4和N_2O的排放量与土壤微生物丰度之间存在显著相关性:CH_4排放量与古菌、产甲烷菌和甲烷氧化菌数量均呈极显著正相关关系(P0.01),而与氨氧化菌数量呈显著负相关关系(P0.05);N_2O排放量与氨氧化菌、甲烷氧化菌、nirK型和nosZ型反硝化菌数量均呈显著正相关关系(P0.05),而与nir S型反硝化菌无显著相关性。研究表明,间隙灌溉和控释肥施用耦合措施通过影响稻麦轮作系统相关功能微生物的群落丰度进而减缓CH_4和N_2O气体的交互排放效应。     

基于高通量测序技术研究玉北油田上方微生物多样性

精确识别活性微生物标识物是目前微生物油气勘探的技术核心,为深入认识各典型油气藏上方油气微生物标识物,采用高通量测序技术研究玉北地区油气富集带上方的油气微生物物种丰度、分布、群落结构等特征.结果显示油气点上方样品较之背景非油气点具有更多的特有物种,其中油气点样品中含199种,背景非油气点样品中含77种.从中共鉴定出10种主要油气微生物,发现其中的3类优势物种(假单胞菌属、芽孢杆菌属和土壤杆菌属)是利用烃类兼性生长的微生物;同时通过解析统计学差异值较高的生物标记物时,发现两种统计学差异值大于5的微生物,分别为背景非油气点上的弧菌科Vibrionaceae维氏气单胞菌和油气点上的方肠杆菌科Erythrobacteraceae赤杆菌.本研究可为油气微生物勘探提供直接实验依据.     

水稻土甲烷氧化菌对镉胁迫的响应

重金属污染影响土壤微生物群落结构与活性,间接影响土壤碳（如CO2、CH4）的生物地球化学循环和全球气候变化。甲烷氧化菌氧化消耗CH4,降低大气中CH4含量,在缓解由温室气体导致的全球温暖化方面起着重要作用。本研究通过短期土壤培养实验,比较研究了不同强度重金属镉（Cd）胁迫下,水稻土中甲烷氧化菌的多度、群落组成及其氧化CH4潜势的差异。结果表明,添加Cd含量越大,水稻土氧化CH4潜势越弱,甲烷氧化菌pmoA基因拷贝数显著减少;甲烷氧化菌多度与水稻土氧化CH4潜势之间存在显著正相关关系（P〈0.001）。群落组成分析发现,在相对低含量Cd（1 mg.kg-1）条件下,有新的甲烷氧化菌菌属出现,而添加较高含量Cd（10 mg.kg-1）时甲烷氧化菌种类减少。总之,Cd胁迫降低水稻土中甲烷氧化菌多样性及其氧化CH4潜势,可能导致原位CH4消耗减少,从而增加稻田CH4排放。     

祁连山冻土区土壤活动层与冻土层中甲烷代谢微生物群落结构特征

冻土土壤中的甲烷代谢微生物可氧化或产生甲烷,影响着甲烷所参与的碳循环过程,对于全球温室气体的释放和调节具有重要的作用.对祁连山冻土区土壤活动层与冻土层中的甲烷代谢微生物产甲烷菌(Methanogens)和甲烷氧化菌(Methanotrophs)的群落结构组成进行研究.通过对产甲烷菌的mcrA基因和甲烷氧化菌的pmoA基因进行PCR扩增,分别构建其基因克隆文库,并通过序列同源比对进行系统发育分析和多样性分析.结果显示:冻土土壤活动层中的产甲烷菌包括Rice cluster Ⅰ、Methanosarcinaceae、Methanomicrobiales、Methanosaetaceae、Methanobacteriaceae五种类型,而在土壤冻土层则包括了Rice cluster Ⅰ、Methanosarcinaceae、Methanobacteriaceae三种类型.土壤活动层的甲烷氧化菌由隶属于α-Proteobacteria(Type Ⅱ)的Methylocystis和隶属于γ-Proteobacteria(Type Ⅰ)的Methylobacter两种类型群体组成,而土壤冻土层中则只包括了Methylocystis这一种类型.由此可见,冻土土壤活动层与冻土层中的甲烷代谢微生物群落结构存在一定的差异.     

黄河三角洲湿地土壤微生物群落结构分析

采用末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术和16S rDNA克隆文库的方法,分析了黄河三角洲滨海湿地土壤不同深度细菌和古菌的群落结构.研究表明,随着深度的增加,细菌群落的多样性下降,而古菌群落多样性则有上升的趋势,且土壤的细菌和古菌群落结构都呈现出规律的层状分布.该土壤包括各种硫酸盐还原菌、产甲烷古菌、光合细菌等丰富的细菌和古菌资源.图5参27     

三十六脚湖水库沉积物聚磷菌多样性及群落组成

采用末端限制性片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)技术结合克隆文库构建,分析福建省平潭岛三十六角湖水库夏冬季特定样点沉积物聚磷菌(PAO)多样性及群落组成.结果显示,三十六脚湖沉积物中夏季聚磷菌的多样性明显高于冬季,夏季优势聚磷菌末端限制性片段(Terminal restriction fragment,T-RF)集中在200-300 bp,而冬季聚磷菌T-RF片段集中在150-200 bp.克隆测序和系统发育分析表明,三十六脚湖水库沉积物样品中检测到优势的聚磷菌类群为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria).夏季丰度大于10%优势的菌属为厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、聚磷小月菌(Microlunatus phosphovorus)和伯克氏菌属(Burkholderia),而冬季丰度大于14%优势的菌属主要有厌氧粘细菌属、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Solibacter属、固氮螺菌属和聚磷小月菌.上述结果表明三十六脚湖沉积物中聚磷菌多样性及群落组成均呈现出一定的季节变化特征,沉积物各形态磷对聚磷菌多样性有一定影响,且与铁铝结合态磷相关性最显著,这可为今后揭示水库沉积物磷代谢循环的微生物学机制提供科学基础.     

宁杞1号枸杞健康株与根腐病患病株的土壤微生物群落和功能差异

根腐病严重制约着枸杞产业的发展,而土壤微生物多样性和物种组成的变化与植株根腐病的发生有密切的关系,因此了解宁夏枸杞根腐病发生与根表、根际和根围土壤微生物群落结构的关系十分必要。应用Illumina MiSeq高通量测序技术对枸杞健康株和根腐病患病株的根表、根际及根围土壤中16S rDNA V3+V4区和ITS1片段进行测序,将结果质控后比对相关数据库进行注释和分析。真菌群落中丰度最高的门和属分别是子囊菌门(Ascomycota)和镰刀菌属(Fusarium),细菌群落中优势门依次为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi),节杆菌属(Arthrobacter)是丰度最高且在根表的丰度显著高于根际和根围土壤,根表、根际和根围3个部位的优势物种组成和占比均不相同。健康株根表的真菌群落丰富度、多样性及均匀度指数均高于患病株(P0.05),而二者的细菌群落α多样性指数无显著差异。功能预测也同样表明健康株和患病株之间的土壤细菌群落功能差异较小,真菌群落中镰刀菌属的功能丰度较高,其在患病株根表和根际的丰度均大于健康株。综上,枸杞健康株和患病株之间,各样品中真菌群落多样性的差异比细菌群落大,二者根表真菌的差异最显著,患病株根表和根际的镰刀菌属的占比和功能丰度最大。该研究分别从土壤真菌和细菌两个角度阐述了宁杞1号枸杞健康株和根腐病患病株的土壤微生物群落和功能的差异,对宁夏枸杞根腐病的认识具有重要意义。     

缺氧嗜甲烷古菌研究进展

综述了缺氧嗜甲烷古菌的分布、生态位、形态与代谢特征的新发现,并讨论了其与产甲烷菌的关系.在无氧条件下,缺氧嗜甲烷古菌与硫酸盐还原菌互养,氧化甲烷气体以阻止其进入大气.缺氧嗜甲烷古菌主要分布于深海甲烷渗漏区和冷泉区域,在其他多种缺氧环境中也能发现,由于还未获得纯培养,对这类微生物的生态位知之甚少.其细胞呈球状、杆状,有时聚集成球状集合体或连接形成丝状体.缺氧甲烷氧化可能经过"反甲烷合成"、"甲基合成"等路径.嗜甲烷古菌与产甲烷菌有着较近的亲缘关系,并且存在许多相似点.图1表1参37     

一株Ⅱ型甲烷氧化菌的筛选及培养条件

甲烷氧化菌能够以甲烷作为唯一碳源和能源物质生存.在甲烷氧化、氯代烃类污染物降解、相关化学品生产等方面具有重要的潜力.利用甲烷作为唯一碳源物质筛选分离得到一株甲烷氧化菌,并对其进行初步鉴定.在此基础上,利用单因子实验和Plackett_Burman实验等方法对获得菌株的培养条件:包括培养基条件(无机氮源种类和浓度、影响显著的金属离子及其浓度、p H值)以及培养温度进行优化.结果表明:经过16S r DNA鉴定,获得菌株与Methylocystis sp.SC2、Methylocystis hiersuta strain SV97等菌株的相似性达到99%,所以确定该菌株属于Methylocystis菌属(Ⅱ型甲烷氧化菌,甲基孢囊菌属),将本菌株命名为Methylocystis sp.M16.以1.0 g/L NH4NO3作氮源,1.0μmol/L铜离子,p H 7.00,温度30℃的条件下,甲烷去除率和菌体生物量最大.在各个因素的最优条件下,Methylocystis sp.M16菌液吸光值(A600 nm)均在0.5以上,甲烷去除率在95%以上.本研究分离得到一株Ⅱ型甲烷氧化菌Methylocystis sp.M16,并获得优化的培养基和培养条件,有望为M16菌应用提供理论参考.     

2-溴乙烷磺酸盐对污泥厌氧发酵过程中乙酸累积及细菌种群的影响

研究了污泥厌氧发酵过程中产甲烷菌被特异性抑制剂——2-溴乙烷磺酸盐(BrCH2CH2SO3-,BES)抑制时乙酸的累积,并采用一种新的微生物分子生态学手段——末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)研究乙酸累积状态下的微生物种群结构.结果表明,BES可以促使厌氧发酵中乙酸的累积,在污泥厌氧发酵初始时一次投加BES条件下,乙酸累积的最大值为1.158gL-1,是阴性对照样最大值的4倍.BES在d4开始投加并每间隔4d补加条件下,乙酸累积最大值为0.851gL-1.微生物种群结构分析表明,对于发酵初始投加BES的样品,乙酸累积主要来源于β-Pro-teobacteria和Sphingobacteria的作用.对于每4d投加BES的样品,Sphingobacteria在中间过程的d8占有较高比例,Bacilli和β-Proteobacteria在整个过程均占优势.图2表2参14     

不同有机肥处理对紫色土油茶林土壤微生物群落结构的影响

为了解不同有机肥处理对紫色土的改良效应,以福建宁化县紫色土水土侵蚀区26年生油茶人工林土壤为对象,采用高通量测序技术对天然物料有机肥、有机无机复合肥、禽畜粪便有机肥共3种有机肥以及不施肥处理下的土壤微生物多样性和群落结构组成进行了研究,并进一步分析土壤理化性质与微生物群落多样性和微生物群落结构的相关性.结果表明:3种有机肥处理下的土壤细菌和真菌群落多样性总体高于不施肥处理;在3种有机肥处理中有机无机复合肥处理下的土壤多样性指数较高;在细菌门水平分类上,3种有机肥处理下,尤以有机无机复合肥处理下的土壤中变形菌门、浮霉菌门、放线菌门和硬壁菌门具有较高相对丰度,而不施肥处理下的土壤中酸杆菌门和绿弯菌门的相对丰度相对较高;在真菌门水平分类上,相较于不施肥处理,3种有机肥处理下的土壤中子囊菌门的相对丰度较高,担子菌门的相对丰度相对较低;变形菌门和酸杆菌门为土壤优势细菌类群,子囊菌门和担子菌门为土壤优势真菌类群;CCA分析所提取的两个主成分分别解释了土壤微生物群落结构门水平60.08%和19.74%的变异,其中土壤容重、自然含水率和全钾含量是影响土壤微生物群落结构变化的重要因子,细菌和真菌多样性指数与土壤自然含水率、容重、pH和全氮含量等土壤环境因子具有显著相关关系.本研究在微生物水平上阐明了不同有机肥处理下的紫色土区土壤生态质量差异,3种有机肥处理尤以有机无机复合肥对紫色土油茶林土壤具有较佳的改良效果.(图8表3参38)     

氮肥对土壤氧化大气甲烷影响的机制

综合评述了氮素对土壤氧化甲烷的抑制机制。包括 :( 1)竞争甲烷单氧化酶的竞争抑制机制 ,( 2 )代谢产物的毒害抑制机制 ,( 3)外源盐引起的微生物生理缺水抑制机制和 ( 4)氮素周转作用引起的抑制机制。提出了氧化菌竞争利用土壤空气有限O2 的竞争抑制机制 ,即氨氧化菌利用更多的土壤有限氧气→产生优势氨氧化菌→形成优势菌群→限制甲烷氧化菌繁殖和功能发挥的氨长期抑制土壤氧化大气甲烷的机制 ,并认为这种抑制作用是不可逆的     

重金属镉对水田土壤微生物基因多样性的影响

采用16S rDNA DGGE分析技术,探讨了不同处理时间、不同浓度镉胁迫条件下水田土壤微生物种群的基因多样性.研究发现,随着处理时间的不同,各处理间的土壤微生物基因多样性差异存在明显不同,培养初期镉对土壤微生物种群毒害作用非常明显,土壤微生物基因多样性下降,但培养后期不同处理之间DNA基因型差异很小,丰度差异较大.在土壤培养初期、含镉3～10 mg/kg的培养基上出现一条新增条带,为对照及低镉浓度土壤所没有,镉形态稳定后会消失,说明土壤中可能存在适官镉浓度下良好生长的微生物种,经序列测定及与网上比对分析.与一株Uncultured bacterium sp.具有96%的相似率,初步确定为一不可培养细菌种,以其作为淹水条件下镉污染初期的报告基因有一定的可行性.     

基于高通量测序技术的铬污染农田土壤菌群多样性及修复菌株的筛选

菌种资源筛选是铬污染土壤生物修复的基础.以铬污染农田土壤为研究对象,采用高通量测序方法分析土壤细菌多样性特征,并根据多样性分析结果,采用选择性培养基和培养方法快速筛选对铬具有适应性和去除能力的细菌,以寻找能在铬污染农田土壤原位修复中具有较大应用潜力的菌种资源.结果显示:受铬污染的土壤细菌群落丰富度和多样性均低于未受铬污染土壤.门水平上,铬污染土壤中放线菌门(Actinobacteria)细菌丰度显著高于未受铬污染的土壤,是两种生境丰度差异最大的门.属水平上,芽孢杆菌属(Bacillus)是铬污染土壤中丰度最高的优势属,显著高于未受铬污染的土壤.从铬污染土壤中共分离到6株能够耐受1 000μg/mL铬的细菌. 6株菌都具有一定的六价铬Cr(VI)去除能力,其中Cr1、Cr3和Cr8能在72 h内将500μg/mL铬培养基中的Cr(VI)全部去除,Cr8能在72 h内将1 000μg/mL铬培养基中的Cr(VI)去除61.2%. 16S rDNA测序结果表明,6株菌中有5株属于厚壁菌门芽孢杆菌属,1株属于放线菌门纤维微菌属(Cellulosimicrobium).结合菌体及菌落形态特征和序列分析结果,铬去除能力最高的Cr8菌可初步被确定为C. aquatile.本研究表明铬污染降低土壤中细菌多样性,根据高通量测序结果有选择性地快速筛选铬污染修复菌株具有可行性,Cr8菌是国内首次分离到的具有铬污染修复功能的纤维微菌属菌株.(图11表5参40)     

17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物群落的影响

为明确17β-雌二醇对岩溶区稻田土壤生态系统微生物多样性-稳定性关系的影响,通过17β-雌二醇室内添加模拟实验,采用荧光定量聚合酶链反应和聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳法研究有氧和厌氧条件下细菌和真菌丰度及多样性变化。结果表明,(1)0.05 mg·kg~(-1)和0.20 mg·kg~(-1)17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物丰度具有一定的表观刺激效应,这种表观刺激效应在厌氧条件下尤为显著。岩溶稻田土壤细菌和真菌总拷贝数及归一化结果进一步显示,17β-雌二醇的添加量为0.05 mg·kg~(-1)时,岩溶稻田土壤微生物丰度最高,这可能是岩溶稻田土壤微生物对17β-雌二醇产生应急反应的一个重要应答点。(2)在厌氧培养条件下,岩溶稻田土壤细菌和真菌均匀度指数与其丰度呈现相反的变化趋势。尽管17β-雌二醇能够促进少数厌氧微生物种属及其数量的增加,但整体上降低了岩溶稻田土壤微生物系统的多样性和稳定性。(3)培养条件与微生物群落的双因素方差分析结果进一步证实,土壤通气状况(有氧和厌氧)是影响岩溶稻田土壤微生物群落稳定性的极显著因素。这说明,定期对岩溶稻田进行翻耕、晒田或水-旱交替耕作能够促进岩溶稻田土壤中17β-雌二醇的降解,降低厌氧微生物活性,缓解17β-雌二醇对岩溶稻田土壤微生物带来的生态风险,从而为岩溶区稻作农业生产管理提供技术支持。