水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建

采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进行特异性、稳定性和重复性指标的检验.结果表明,利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.353,R2=0.995);实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在81℃±0.5℃的PCR产物是轮状病毒VP7序列上的特异性产物,表明此标准品是轮状病毒特异性的;同时,所制备的标准品在实时定量PCR检测中具有较大的线性范围(9×100～9×1011 copies/μL,每个反应最低可以检测到9个拷贝数的轮状病毒cDNA,表明利用该标准品进行实时定量PCR分析时具有较高的检测灵敏性;此外,该标准品具有较高的稳定性和重复性(3次独立实验CV值在0.2%～0.9%之间),可长期稳定保存.构建的标准品可用作检测水环境中轮状病毒的实时荧光定量PCR的外标准品.     

倏逝波荧光免疫传感器在环境检测中的研究进展

倏逝波荧光免疫传感器是利用光波在波导内,以全反射方式传输时在波导界面产生倏逝波,结合荧光免疫分析原理进行检测的一类新型传感器.该类传感器具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、费用低、操作简便等优点,在环境检测、医学临床、食品卫生等领域具有广泛的应用前景.在介绍倏逝波荧光免疫传感器原理、结构及其特点的基础上,综述了该类传感器在环境检测领域的研究进展.     

基于平面波导传感器的恩诺沙星与诺氟沙星同时检测方法

为了实现对于环境中抗生素恩诺沙星与诺氟沙星的同时快速灵敏检测,本研究基于间接竞争免疫反应模式及荧光全内反射原理,以本课题组自主研发的平面波导生物传感器为平台,建立了恩诺沙星和诺氟沙星的同时快速检测方法.通过对抗体浓度、pH及钙离子浓度的优化,提高了检测方法的灵敏度,结果表明,恩诺沙星的检测限为0.34μg·L~(-1),诺氟沙星的检测限为0.14μg·L~(-1).在单物质检测的基础上,首次实现了基于平面波导传感器的两种抗生素同时检测,检测周期仅15 min,检测限为0.06μg·L~(-1).本研究从理论上分析了同时检测时检测限下降、灵敏度提高的原因,为利用生物传感器法同时检测抗生素提供了理论指导及技术支撑.     

有毒难降解有机物的污染及防治对策

随着近代工业，尤其是有机化工、石油化工、农药等工业的迅速发展，有机化合物的产量和种类与日俱增，其污染程度和范围令人惊叹，特别是在发达国家和地区，这一问题尤为突出。有毒有机污染物对环境的污染和危害已成为当前世界上重大环境问题之一。1．有机行买物纵观工业污染的演变史，正是工业发展史的缩影，它可分为以下三个阶段：第一阶段是18世纪到19世纪，当时主要是酸、减和需氧有机物造成的污染；本世纪20年代到40年代是第二阶段，由于炼焦、煤化学工业和石油工业的发展，油、酚、氰等化学污染日益严重；第三阶段是本世纪50年代以后…     

基于CTC-流式细胞仪活性细菌总数的快速检测技术研究

以大肠杆菌作为研究对象,建立一种5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride(CTC)染色结合流式细胞仪(CTC-FCM)的方法,以选择性检测水环境中具有代谢活性的细菌总数.该方法的原理是细菌与具有氧化还原性的染料CTC发生反应,形成红色荧光物质,被流式细胞仪特异性识别进而可选择性检测活性菌.研究结果表明,CTC染色的最佳反应条件为:CTC浓度为2 mmol·L-1、37℃避光孵育3h.该方法最低检测限为103个·mL-1.通过比较培养法和CTC-FCM方法检测热灭活后的大肠杆菌,结果表明CTC-FCM方法可准确区分活性菌和灭活菌,且与培养法之间具有较好的线性关系(R2=0.9465).应用CTC-FCM方法检测实际样品,结果显示该方法与培养法之间有较好的线性关系(R2=0.8121).本研究建立的CTC-FCM方法可满足饮用水水质标准需求,且检测时间比平板培养法缩短20～40 h,可以用于环境水样中活性细菌总数检测.     

环境样品免疫检测基质效应分析与控制

免疫检测技术以其特异性强、灵敏度高、分析容量大、反应速度快、检测费用低廉等优点,逐渐成为环境样品大规模快速筛查和预警监测的首选技术.由于免疫检测无需样品预处理、能实现对样品的在线检测,因此环境样品中复杂的基质可能对免疫检测产生非常大的干扰和影响.以水环境中微囊藻毒素-LR的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测为基础,系统地考察了环境样品中各种背景基质对ELISA检测的影响,评价了各个基质的影响规律和程度,并研究提出了相应的控制和消除各不利影响的方法,最后统一提出水环境样品免疫检测抗基质效应干扰的控制方案,即采用10×PBS＋1%BSA＋0.5%EDTA作为免疫检测反应的缓冲体系,能有效消除各基质效应对免疫检测的干扰.该方案同样适应于其它不需要对环境样品进行预处理的免疫检测技术.     

恩诺沙星完全抗原的合成及间接竞争ELISA方法的建立

为了建立环境新型抗生素类污染物恩诺沙星的免疫检测方法,采用间接竞争ELISA方法,用酶标仪测定酶标二抗与底物反应生成的有色产物量来确定恩诺沙星含量.研究了恩诺沙星完全抗原的合成方法,以及间接竞争ELISA的优化条件和实际水样的检测效果.结果表明,通过碳二亚胺法(EDC+NHS)成功合成了恩诺沙星的理想完全抗原,采用BCA法测定完全抗原浓度,紫外吸收法和MADLI-TOF MS法测得完全抗原的偶联比为14~16.建立的恩诺沙星间接竞争ELISA检测方法,检测限为1.92μg·L~(-1),定量检测区间为7.33~238.24μg·L~(-1).采用优化后的实验条件测定了清华大学地下水和饮用水配制的恩诺沙星加标样品,发现所有样品的变异系数和回收率分别为3%~11%和82%~122%,表明建立的间接竞争ELISA方法适用于实际水样中恩诺沙星的快速简便检测.     

pUCD-recA重组发光菌构建及对遗传毒性污染物响应作用

基因重组发光菌在水质毒性的评价中具有重要的作用,本研究从分析污染物毒性损伤的机制出发,构建新型pUCD-recA基因重组发光菌. 用PCR法从大肠杆菌W3110中扩增recA基因,将其与pGEM-T easy载体连接后测序.测序正确的recA片段及pUCD615载体均用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,连接后电转化导入宿主菌JM109.挑取克隆,提取质粒用PCR鉴定,阳性克隆再进行测序.将构建成功的pUCD-recA载体转化入大肠杆菌RFM443,加入相应的遗传毒性污染物,观察发光响应作用.结果表明,recA基因PCR扩增出的片段为293　bp,测序结果与GenBank中的recA序列进行BLAST比对,同源性为99％,表明扩增序列正确.与pUCD615载体连接后的测序结果表明,recA基因已正确地插入到pUCD615的多克隆位点,方向和读码框正确,重组发光菌载体构建成功.将构建好的重组载体转化入RFM443宿主菌,加入遗传毒性污染物观察响应效果.丝裂霉素C（MMC）对pUCDrecA重组发光菌诱导效果最好,0.01 mg/L即可有很好的响应曲线;N′-甲基N′-硝基亚硝基胍（MNNG）则在50～100 mg/L时可发挥最佳响应作用.     

巢湖主产鱼类肌肉中抗生素污染特征、来源及健康风险评估

为评价巢湖主产鱼类肌肉中抗生素的污染特征和风险水平,采用快速溶剂萃取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱联用技术(ASE-SPE-LC-MS/MS),对巢湖湖区7种主产鱼类和4条入湖河流鲤鱼肌肉中的抗生素浓度进行分析.结果显示：(1)从巢湖鱼类肌肉中共检出3类15种抗生素,单个抗生素浓度范围从未检测到(n.d)到76.95 ng/g,氟喹诺酮类(FQs)抗生素含量占比为77%,占主导地位.(2)通过对比不同水域和不同生活习性鱼类肌肉中抗生素的浓度发现,河流鱼类肌肉中抗生素总浓度高于湖区,底栖鱼类肌肉中抗生素浓度高于中上层鱼类,说明鱼类生活环境和摄食习惯对抗生素在鱼体内的积累有影响.(3)通过主成分分析(PCA)发现,巢湖鱼体内抗生素可能来源于生活废水、医疗废水、畜牧水产养殖废水,同时鱼体中抗生素的来源还受鱼类摄食习惯的影响.(4)通过健康风险评估发现,巢湖鱼类肌肉中检出抗生素的健康风险熵(HQ)范围为4.8×10^-6-4.0×10^-2,危害指数(HI)的范围为1.9×10^-3-4.9×10^-2,二者最...     

氯代芳香化合物生物降解性能与其化学结构的相关性

应用结构－活性定量关系研究方法,对氯代芳香化合物的好氧生物降解性能与其化学结构间的关系进行了研究,并建立了受试物的好物降解速率常数与４个高阶分子连接性指标及取代基电子效应数为结构参数的定量关系,分析表明,有机物取代基的电性能数和空间构型是影响受试物好氧生物降解性能的２个重要因素。