邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物，以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板，扩增出邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O)基因，将该基因和表达载体pET—30a( )连接，转化E.coli JM109(DE3)，获得了高效表达的转化子，SDS—PAGE结果表明，转化子的C23O蛋白不仅在细胞内存在，而且能被分泌到胞外，薄层扫描显示，转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的42％，酶活分析表明，分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C23O比活力，Southern杂交将菌株ZL5的C23O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上。图5表1参12。     

地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的基因克隆和鉴定

通过PCR技术从Bacillus licheniformis CICIM-B2004染色体DNA中克隆出编码β-甘露聚糖酶成熟肽的基因manL,并对其进行了鉴定.manL由1110bp组成,编码由332个氨基酸残基组成的β-甘露聚糖酶成熟肽.将manL在大肠杆菌JM109中表达,在12h内可表达325u/mLβ-甘露聚糖酶.图4表1参23     

斜带石斑鱼alpha型与rho型GST基因cDNA全序列的克隆与分析

为从分子水平上研究II相去毒酶谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)等海水鱼类机体内代谢去毒过程中的作用及机制,采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆得到斜带石斑鱼肝脏alpha-GST(GSTA)、rho-GST(GSTR)基因cDNA全序列.序列分析结果表明,斜带石斑鱼肝脏GSTA基因cDNA全长1008bp,编码223个氨基酸;GSTR基因cDNA全长1002bp,编码225个氨基酸.构建系统进化树发现,斜带石斑鱼与鲤鱼、斑马鱼GSTA氨基酸同源性较高,而GSTR为鱼类所特有并共同占据进化树上独立的分枝,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物GST现有所有类型同源性均较低.     

马铃薯X病毒山西分离物外壳蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

对GenBank公布的马铃薯X病毒的基因组核苷酸序列和外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了同源性比对分析.结果表明,马铃薯X病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的同源性要高于基因组全序列的同源性,并且外壳蛋白基因3'端核苷酸序列的同源性又高于5'端.设计一对特异性引物,以马铃薯感病植株的总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到了马铃薯X病毒外壳蛋白基因.该基因含714个核苷酸,编码238个氨基酸.核苷酸序列比对结果表明,该基因与Genbank公布的马铃薯X病毒其他分离物的外壳蛋白基因的同源性为80.2%～97.5%,且3'端的同源性要高于5'端.上述结果预示,RNA干扰抗病毒基因工程中,利用马铃薯X病毒外壳蛋白基因的3'端比用5'端是更好的策略.     

邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)基因的定位、克隆和表达

射性同位素标记ｔｆｄＣ基因片段作探针,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交定位Ｌ１菌株的邻苯二酚１,２双加氧酶基因位于ＰｓｔⅠ的Ｉ片段和ＢａｍＨⅠ的Ｍ和Ｎ片段．低熔点琼脂糖回收ＰｓｔⅠ的Ｉ段,直接克隆至表达载体ｐＫＴ２３０上,获得重组子ｐＫＴ２３０ｐ．重组子转化不具开环酶活性的甲胺磷降解菌Ｐ２,获得高效的Ｃ１２Ｏ酶活     

硝基苯降解菌的分离鉴定及降解特性

从化工厂污水处理池污泥中分离到一株能高效降解硝基苯的菌株XY-1,通过形态观察、生理生化特征和16SrDNA序列同源性分析,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).该菌株能以硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长,硝基苯初始浓度为200 mg/L时,20 h降解率可达97%.该菌在温度25～35℃、pH 7.0～9.0范围内均能高效降解硝基苯,并且对对氯硝基苯、对氯苯胺也有良好的降解效果.测序分析表明,克隆到了该菌中的硝基苯还原酶基因,推测该菌的降解途径是硝基苯部分还原途径.图6参19     

玉米秸秆厌氧降解复合菌系的微生物群落结构

以不同来源具有木质纤维素降解能力的环境样品为接种物,以玉米秸秆为唯一碳源,进行了秸秆厌氧降解微生物的驯化培养,构建了8组复合菌系.复合菌系的产气周期为30～50 d,玉米秸秆的总固体(TS)去除率在30%～40%之间.其中6组的甲烷产量(以TS计)为62.1～118.4 mL.g-1,发酵液中挥发性有机酸主要为乙酸、丙酸及丁酸(100～500 mg.L-1),发酵终产物pH为6.5～6.7;而另外2组的甲烷产量较低,在8.5～9.7 mL.g-1之间,但乙酸浓度较高(1 200 mg.L-1左右),发酵终产物pH为5.6～5.9.通过16S rRNA基因克隆文库方法对复合菌系中细菌及古菌的群落结构进行了多样性解析,结果表明细菌主要分为8个不同的类群,其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、互养菌门(Synergistetes)及热袍菌门(Thermotogae)为优势菌群,分别占细菌克隆总数的37.8%、34.3%、11.6%和6.4%;古菌属于甲烷微菌纲(Methanomicrobia)和甲烷杆菌纲(Methanobacteria),分别占古菌克隆总数的61.1%和38.9%.对主要功能菌群在秸秆厌氧降解产甲烷过程中发挥的作用进行了探讨.     

绿色荧光蛋白基因在根际优势菌株中的高效表达

从人工模拟污染土壤中的黄麻根际分离得到两株优势菌株。通过PCR技术对增强绿色荧光蛋白基因与质粒载体pTnMod Ocm进行体外重组构建新的质粒 ,并转化分离得到的优势菌株。结果表明增强绿色荧光蛋白基因在黄麻根际优势菌株中高效表达     

大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的克隆与表达

采用RTPCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增HO1基因,将该基因克隆进pGEMTeasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,分析基因,酶切后与含有乳酸乳球菌启动子NisA的pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养.用Nisin诱导HO1表达,SDSPAGE和Westernblot分析、鉴定表达产物,并且用分光光度法测定工程菌表达的HO1活性为0.45nmolmg(protein)-1h-1.图5参18     

非纯培养物细菌蛋白酶DNA片段的克隆与表达

为了构建更多的蛋白酶基因工程菌,以及进行蛋白酶基因的直接进化研究,从非纯培养细菌总DNA中扩增各种编码蛋白酶的DNA片段.根据MEROPS和GenBank数据库中的枯草杆菌类蛋白酶的编码区和成熟肽编码序列设计并合成了10条引物.富集培养胞外蛋白酶产生菌并提取了12个总DNA样品,分别用每对引物在降落PCR (TouchdownPCR, TD-PCR)条件下进行蛋白酶编码序列的扩增.选择了19个长800 ~1 200 bp的扩增片段测序,其结果为: 8个是蛋白酶DNA片段,它们应属于4种不同的蛋白酶基因序列;同一对引物扩增到的基因序列差异性可达到32%,说明只使用基于已知序列的PCR方法从混合菌中获得新蛋白酶基因是可行的.将克隆到的1个与碱性蛋白酶E (GenBank No.AJ539133)的编码区99%相似的蛋白酶DNA片段插入pTWIN1载体,在大肠杆菌ER2566中进行表达.结果表明,表达的成熟蛋白酶可分泌到培养基中,能在牛奶平板上产生水解圈,对大肠杆菌有致死作用.图5表3参14