产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260 U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40 g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12 h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4 h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5 g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.图6表1参18     

一种新的中温酸性α-淀粉酶的分离纯化及酶学性质

从Bacillus sp.中分离纯化了一种新的中温酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究.粗酶经硫酸铵沉淀、 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、 Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤后获得电泳均一的α-淀粉酶,其分子量(Mr)约为56×103.该酶最适反应pH为5.0,在pH 5.0～11.0范围内稳定,具有较好的耐酸特性.该酶最适反应温度为40～50 ℃,在40～60 ℃范围内稳定.在60 ℃、 pH 4.5时,该酶能快速有效水解可溶性淀粉;在pH 5.0时该酶对多种生淀粉底物也具有良好的水解作用.因此,该酶有助于解决中温条件淀粉加工行业中,液化酶和糖化酶由于适用pH值的差异而无法联用的难题,是一种具有研究价值和应用前景的中温酸性α-淀粉酶.经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中两个肽段的氨基酸序列,通过比对发现,该酶与NCBI中已报道的α-淀粉酶序列具有一定的同源性,同时,在氨基酸水平上也存在着差异.     

灵芝TR6号漆酶的分离纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯漆酶.SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶表观分子量为62×103.Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成,为单体酶.试验结果表明,该漆酶的最适反应温度为60℃,与ABTS的最适反应pH为4.5,Km为0.188 mmol/L,在pH 6.0～8.0之间较稳定.Fe2 、SDS和Tris对该漆酶活性具有抑制作用,EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用.图8表2参10     

两株抗乙酰羟酸合酶类除草剂克雷伯氏菌的分离及其AHAS基因ilvIH的克隆

乙酰羟酸合酶(AHAS)是磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、磺酰胺类和嘧啶水杨酸类等乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的作用靶标,获得能抗此类除草剂的AHAS突变基因资源具有非常重要的理论和应用价值.本文从长期使用磺酰脲类除草剂的农田土壤中分离到2株抗性细菌HR9和HR11,根据其表型特征、生理生化特性和16SrDNA序列系统发育分析,初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.).菌株HR9和HR11对甲磺隆的最高耐受浓度分别达到9 600 μmol/L和8 200 μmol/L,且对各种乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂具有交叉抗性.利用PCR技术从HR9、HR11和实验室保存的一株除草剂敏感型克雷伯氏菌LB-2的总DNA中克隆到编码AHAS的基因ilvIH,其中ilvI编码大亚基即催化亚基,ilvH编码小亚基即调节业基.比对结果表明,菌株HR11与菌株HR9的ilvI有6个位点的氨基酸存在差异,HR9、HR11与LB-2的ilvI各有20和16个位点的氨基酸存在差异.     

毒死蜱与乙草胺单一污染和复合污染对土壤酶活性及微生物生物量碳的影响

采用室内模拟试验方法,研究毒死蜱与乙草胺单一污染和复合污染对土壤酶活性与微生物生物量碳的影响.结果表明,在试验剂量范围内,毒死蜱与乙草胺单一污染和复合污染对过氧化氢酶都产生抑制作用,而对脲酶有激活效应,对酸性磷酸单酯酶和碱性磷酸单酯酶的影响表现为先激活后抑制的效应,其中乙草胺单一污染对过氧化氢酶和酸性磷酸单酯酶抑制作用显著.毒死蜱与乙草胺在单一污染和复合污染的初期能提高土壤微生物生物量碳,但至第14天后复合污染显示出抑制作用.     

UV—B辐射增强对苹果采后炭疽病发病情况和抗病相关酶活性的影响

模拟UV-B增强的实验条件,在人工接种的情况下,比较了苹果采后炭疽病的发病情况,测定了一些与抗病相关酶的活性.UV-B增强后,苹果炭疽病斑直径、病斑扩展速率降低,发病指数较对照下降了58.83%.POD活性在处理后第7天时达最大值,为处理前的1.76倍,PPO活性在处理后第6天增加到对照的1.5倍.PAL活性在第6d提高1.74倍,几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性都有所升高,且它们的变化时程一致.结果表明:UV-B增加限制了苹果采后炭疽病的发展,诱导果实中防御酶活性.     

铅污染对菱幼苗SOD、POD及叶细胞亚显微结构的影响

不同浓度Pb2+溶液处理菱(Trapa bicornis Osbeck)幼苗后,考察了菱幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)以及叶细胞亚显微结构出现的变化,并初步探讨了Pb2+的毒性机理.结果表明,SOD的活性与铅离子浓度(5~20mg/L)表现出明显的剂量-效应关系, Pb2+浓度愈大,毒害程度愈深.POD活性在较低浓度(5,10mg/L)作用下,持续升高;在较高浓度(15,20mg/L)下,其活性出现先上升后下降的趋势.电子显微镜观察发现,在20mg/L Pb2+溶液处理7d后,叶细胞的叶绿体基粒数目减少,基粒片层解体,叶绿体双层膜断裂;线粒体、高尔基体、内质网等解体消失;细胞核的染色质与核质遭到破坏,核膜破裂.同样处理条件的叶片组织总DNA电泳显示,DNA完全断裂呈现弥散状,提示Pb2+毒害所致细胞死亡有别于细胞程序性死亡. Pb2+对菱的毒害是多途径综合作用的结果.     

NO2——N对铜绿微囊藻生理特性的影响

采用藻类生物测试标准方法研究了不同NO2--N初始浓度条件下铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的生长及生理变化.结果表明,相对BG11(NO2--N初始浓度为0)培养基,低初始NO2--N浓度(1,10mg/L)条件下铜绿微囊藻生长良好;高NO2--N初始浓度(20,30,40mg/L)条件下藻生长缓慢甚至停滞. NO2--N初始浓度由10mg/L到30mg/L,亚硝酸还原酶(NiR)活性和过氧化氢酶(CAT)活性呈增加趋势;在NO2--N初始浓度分别为20~30mg/L和20~40mg/L时,叶绿素a(Chl-a)含量和丙二醛(MDA)含量随NO2--N浓度增大而逐渐升高;在初始NO2--N浓度0,1,10,20,30mg/L条件下硝酸还原酶(NR)没有明显变化.这表明,铜绿微囊藻在NO2--N初始浓度10,20,30mg/L条件下能维持一定的生长,主要由于藻叶绿素含量的增加,NiR活性和防止细胞过氧化的酶CAT活性的提高所致.     

一株产木聚糖酶的耐冷皮壳正青霉菌鉴定与酶谱分析

从青海冻土中分离得到1株产木聚糖酶的青霉菌QH11,通过菌落特征观察、显微特征观察和18S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为皮壳正青霉,其最适生长温度为20℃.该菌以玉米芯水不溶木聚糖为碳源,于20℃摇瓶培养,d 4木聚糖酶达到高峰,酶活为28.13 U/mL,比酶活为9.73 U/mg,粗酶液的最适温度为47.5℃.SDS-PAGE和酶谱分析表明,该菌可产生3种木聚糖酶,其亚基相埘分子质量(Mr)分别为20.5×103、23.0×103和35.0×103.图6参15     

梨形环棱螺保护酶分子标志物在大运河污染评价中的应用

运用室内模拟法、样点笼内放养法和直接采样法研究京杭大运河不同污染程度环境对梨形环棱螺内脏团中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响.结果表明:梨形环棱螺组织抗氧化保护酶系统的SOD、POD、CAT活性是指示污染的敏感指标,其监测结果与水质化学评价结果基本一致.CAT活性在临界范围内随着污染程度加深,抑制作用加强.POD活性在污染环境中被激活, 但各时间段的增幅不尽相同.SOD活性变化不稳定,较适合作为短时间内的监测指标.比较而言,这3种测定保护酶分子标志物活性的试验方法以样点笼内放养法最优,直接采样法最不可取.