功能宏基因组学在新型抗生素耐药基因研究中的应用进展

抗生素耐药性是二十一世纪人类面对的最严峻的环境健康问题之一.抗生素耐药基因(Antibiotics resistance genes, ARGs)被认为是一类新型环境污染物.当前针对ARGs的主要研究方法有细菌分离和培养法、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、和宏基因组法.然而,仅有功能宏基因组方法能发现新型的ARGs.功能宏基因组方法利用新一代测序技术的高通量的特性,结合分子生物学技术和功能筛选构建有关抗生素耐药性的基因库,通过生物信息学分析高效地发现新型ARGs.本文综述了近来利用功能宏基因组技术筛选新型ARGs的相关研究进展,总结了功能宏基因学相关的技术和方法的优势和限制,并展望了功能宏基因学方法进一步发展的方向.     

基于抗生素抗性分析的细菌源示踪方法研究

为建立基于抗生素抗性分析的细菌源示踪方法,对5种不同物种源(人、狗、鸡、牛、猪)粪便中分离得到的肠球菌进行耐药性检测,初步建立不同物种源肠球菌抗生素抗性图谱库,并用SPSS15.0软件对图谱库进行判别分析.结果表明,基于物种源的5分类模式图谱库的源验证和交叉验证的平均正确归类率(ARCC)分别为53.1％和52.4％,...     

东亚飞蝗辅酶Q-细胞色素C还原酶基因克隆和序列分析

辅酶Q-细胞色素C还原酶是组成线粒体呼吸链的4种酶复合体之一,对线粒体呼吸链的电子传递起着重要作用.同时,辅酶Q-细胞色素C还原酶还是杀真菌剂(Fungicide)、抗原虫(Antiprotozoan)、抗癌药物(Anticancer drugs)以及抗疟疾(Antimalarial)药物——阿托喹酮(Atovaquone)、氯胍(Proguanil)、布帕伐醌(Buparvaquone)的作用靶标,可将它作为昆虫的药靶,设计和开发新型的杀虫剂.采用RACE方法,克隆了东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis(Meyen)]辅酶Q-细胞色素C还原酶cDNA全序列(GenBank登录号:GU593056.1).获得的cDNA全长939 bp,其中可读框819 bp,编码272个氨基酸,推测其相对分子质量为29.48 ku,等电点为9.19.通过与其它10个物种的细胞色素C还原酶基因的氨基酸序列进行比对,发现东亚飞蝗与家蚕、赤拟谷盗、黒腹果蝇、埃及伊蚊、致乏库蚊、小家鼠、人、丽蝇蛹集金小蜂、蜜蜂和豌豆蚜的辅酶Q-细胞色素C还原酶氨基酸序列同源性分别为72%、72%、66%、63%、60%、59%、59%、58%、57%和56%.     

废水生物强化处理技术研究进展

生物强化技术具有高效去除目标污染物、加速系统启动、提高系统抗水力及有机负荷能力以及优化系统菌群结构和增强功能稳定性等功能,在废水生物处理实际应用中潜力巨大.总结了国内外废水生物强化处理技术研究进展,在功能微生物选育方面,通过传统选育手段与基因工程手段并举来实现;在功能菌应用与生物强化处理工艺方面,主要通过所投加的功能菌直接作用或是利用基因水平转移(HGT)来实现生物强化;在分子检测技术方面,随着分子生物学的发展,一些技术如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、核糖体间隔基因分析方法(RISA)及荧光原位杂交(FISH)等在与微生物生态学研究中得到了广泛应用.分析认为,应用分子生物学等先进技术手段,探讨废水生物强化处理工程应用过程中的微生物生态学机制,并以此为指导研发高性能菌剂,将是本领域的研究重点与方向之一.     

Bt肠毒素基因与plcR基因的相关性及肠毒素对小鼠的急性毒性

用PCR方法检测溶血肠毒素BL、肠毒素T和肠毒素S三种肠毒素基因(hblA、becT、entS)及毒素调控基因plcR在30株苏云金芽胞杆菌株(Bt)中的分布.结果表明,含有hblA基因、entS基因、becT基因及plcR基因片段的Bt菌株分别占66.7%、70%、70%和73.3%.其中,含有plcR基因的菌株都至少含有一种肠毒素基因,不含肠毒素基因的菌株也未检测到plcR基因,说明plcR基因与肠毒素基因有着密切的关系.用3个Bt菌株WB9、HD2和HD9(都含有hblA、becT、entS和plcR基因片段,HD2和HD9经RPLA与TECRA肠毒素检测试剂盒检测具有高滴度)对小白鼠进行口服急性毒性试验.结果表明,所有3种供试菌株的发酵上清液对小白鼠行为和健康没有明显影响,对内部器官(心、肝、肺等)也没有产生病理现象.图5表3参14     

rRNA基因ITS区序列分析在粘帚霉属生防菌株种级分类上的应用

对分离自不同地域的粘帚霉属不同种类的生防菌株rRNA基因转录间区进行了克隆测序,用Clustal X软件进行自动排序,用Njplot程序构建系统进化树.供试26个粘帚霉菌株分在4个组,与传统形态分类结果一致,同一种类的不同来源的菌株差异不明显.研究表明,可以根据ITS区DNA序列差异对粘帚霉属进行种级分类,但不能用于区分种内不同地域的菌株之间的差别.图1表1参17     

根癌农杆菌介导工业化产甘油假丝酵母的遗传转化

通过构建质粒pCAM3300-zeocin,将其电击转化到根癌农杆菌LBA4404中.将含有目的质粒pCAM3300-zeocin的根癌农杆菌和工业化产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5共培养,利用zeocin抗性基因为筛选标记,实现了pCAM3300-zeocin对产甘油假丝酵母的转化.并根据产甘油假丝酵母的生长特性,对转化条件进行了优化,在共培养时间为24h,产甘油假丝酵母和根癌农杆菌的细胞比例为1∶(500～1000)时最高转化率达到2个转化子/104个酵母细胞.初步建立了根癌农杆菌介导转化产甘油假丝酵母的转化方法.     

瞬时表达比较马铃薯X病毒CP基因3种结构对RNA沉默的诱导效果

RNA沉默是植物抵御病毒侵染的一种防卫机制,病原来源的抗性(pathogen-derived resistance,PDR)被认为是通过RNA沉默起作用的.转化的核酸片段在基因组中的位置、长短和不同排列结构等均影响RNA沉默的效率.用全长马铃薯X病毒(PVX)CP基因构建非翻译的正义、反义和反向重复结构转基因的植物表达载体,通过农杆菌渗入法瞬时表达测试了这些转基因对RNA介导抗性的诱导效率和有效性.结果表明,反向重复的PVXCP是更为有效的RNA沉默诱导因子,同时也证明让目的基因在受试植物中瞬时表达,在转化植物之前能比较快速地检测转基因的表达情况以及表达产物的功能,从而节约时间和资源,并减少盲目性.图3表2参21     

牛蛙生长激素基因在COS7细胞中的转染表达

应用RT-PCR技术克隆牛蛙生长激素(BfGH)的cDNA,T-A克隆法构建反向插入的pMD18-T/BfGH重组质粒,回收BamHⅠ酶切的BfGH cDNA片段,并与去磷酸化处理的真核表达载体VR1020/BamHⅠ,酶切鉴定方法筛选BfGH正向插入的重组真核表达质粒VBfGH.脂质体法介导质粒VBfGH转染哺乳动物细胞COS7,对转染后的COS7细胞进行RT-PCR、ELISA和免疫荧光检测,分别在转录和翻译水平证实BfGH基因在COS7细胞中得到了正确的转染表达.图4表1参17     

AzaC预处理增加TCDD对特殊细胞P450基因的诱导

利用RT-PCR检测不同物质诱导细胞的CYP基因 mRNA的表达水平.在HepG2细胞,TCDD能诱导CYP1A1、CYP1B1及CYP1A2基因表达,CYP1A1、CYP1B1基因比CYP1A2基因更容易被诱导,用AzaC处理后CYP1B1基因表达无改变;在A549细胞和SPC-A1细胞,Azac预处理后增加了TCDD对CYP1家族的诱导.也就是AzaC增加了CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1基因表达水平.图1表1参10