纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定

利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得了纳豆激酶成熟肽基因(NK),从而构建了大肠杆菌表达质粒NK/pTWIN1,NK/PET32a及NK/PML-c2x,经分别转化宿主菌ER2566,BL21和ER2566,获得了转纳豆激酶基因重组菌.结果表明,NK/pTWIN1-ER2566和NK/PET32a-BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高.本研究选用NK/pTWIN1-ER2566作为表达菌株,对其进行发酵表达.SDS-PAGE显示,目的蛋白约占菌体总蛋白的36%,该蛋白是以包涵体形式存在的.包涵体经收集、蛋白变性及复性,并经过SP Sepharose分离纯化,得到了纯化的纳豆激酶蛋白,琼脂糖-纤维蛋白平板法测出1mg纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于600u尿激酶.本文从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为利用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础.图5表1参11     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)过氧化氢酶的分离纯化及性质

对产自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WSHDZ-01的过氧化氢酶,通过乙醇沉淀、DEAE阴离子交换层析、疏水层析3步纯化,最终获得电泳纯的目标酶(纯化6.8倍).该过氧化氢酶的亚基相对分子质量(M1)为63×103,在405 nm处显示特征吸收峰,推测含有血红素.计算获得酶的表观米氏常数为26.87 mmol L-1.该过氧化氢酶不受低亚硫酸钠的还原作用影响,但被氰化物、叠氮化物和3-氨基-1,2,4-三唑(单功能过氧化氢酶的专一抑制剂)强烈抑制.以邻苯二胺作为电子供体测定酶活时,该酶不显示过氧化物酶活性,因此本文将纯化的过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶.此外,该酶具有热敏感的特点,且酶活在pH 5～10范围内不受pH影响,此后,活性随着pH的升高而升高,并在pH 11～12处有明显的酶活高峰,在pH 11、25℃放置60 min酶活基本不变,表明该酶在高碱条件下具有很高的活力和一定的稳定性.     

盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶不同结构域蛋白的表达纯化及其抗体的制备与分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质.3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐生杜氏藻甘油合成途径中的关键酶.与已经报道的其它物种的GPDH基因不同,盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶(Ds.GPDH)基因具有两个独立的功能结构域,即丝氨酸磷酸化酶结构域(SGPP domain)和3-磷酸甘油脱氢酶结构域(GPD domain).本实验在已克隆的Ds.GPDH2基因的基础上,以含GPDH2全基因序列的T质粒载体(pMD18-T-GPDH2)为模板,PCR扩增分别得到两个单结构域片段(SGPP与GPD),以及双结构域片段(GPDH),构建了pET32a-SGPP、pET32a-GPD和pET32a-GPDH三种原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达.纯化蛋白制备抗原,制备出3个多克隆抗体.Western Blot和交叉反应分析显示通过重组蛋白制备的多克隆抗体具有很高的特异性.图7参16     

木质素降解菌的分离鉴定及木素过氧化物酶的纯化

采用苯胺蓝脱色法,从活性污泥中分离筛选得到2株具有分泌木质素降解过氧化物酶能力的细菌菌株PKE117和PKE225.根据生理生化反应结果和16SrDNA序列分析,初步确定菌株PKE117为Pseudomanas属的1个新种,PKE225为Pseudomanas thermaerum的1个新菌株.对于菌株PKE117的发酵液依次经DEAE-纤维素32、Sephadex G-75凝胶过滤纯化,木素过氧化物酶的藜芦醇氧化比活力从0.87U/mg提高到204.5U/mg,酶的纯化倍数为235.1,回收率15%.     

壬基酚降解酶的分离纯化及性质研究

从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X-8中分离纯化出一种壬基酚降解酶,研究其酶学特性.将该菌株X-8在NP-尿素培养基中振荡培养26 h(30℃),其细胞经超声波破壁,得到粗提酶液.粗提酶液经硫酸铵分级盐析、透析脱盐、Sephadex G-200分子筛柱层析、DEAE-Sepharose Fast' Flow离子交换层析,得到凝胶电泳均一的NP降解酶.SDS-PAGE电泳结果表明,该酶相对分子质量为37 000±1,适宜作用条件为30℃、pH=7.0.该酶在pH=7.0～10.0、10～50℃时非常稳定.本研究得到的壬基酚降解酶活力强,常温下反应速度快、稳定性高,可用于污水中壬基酚的生物降解.将壬基酚降解酶纯化至电泳纯时工艺复杂、收率较低,但实际应用中只需对该酶进行粗分离,其工艺简单、收率高,因此该酶可用于含NP废水的处理.     

活性污泥总DNA提取方法的比较

从处理某制药废水的MBR反应器中采集活性污泥,评价不同DNA提取方法对其总DNA提取效率的影响。DNA提取分细胞裂解和DNA纯化2步,对细胞裂解比较了珠磨匀浆法、反复冻融法、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）裂解法等7种方法;对DNA纯化比较了酚/氯仿纯化法和胶回收纯化法。结果表明,SDS裂解法、酚氯仿纯化法最优。通过条件优化实验,确定SDS裂解酚/氯仿纯化法在污泥量1.1 g,10 000 r/min离心5 min的操作条件下,获得的DNA产量（10 774 μg/g泥重）和纯度（OD₂₆₀∶OD₂₈₀=1.84）等综合指标最好。     

三达膜科技(厦门)有限公司

三达膜科技(厦门)有限公司创立于1996年12月,公司坐落于厦门市集美区杏林中亚城三达科技园,占地面积10万m2。公司现有职工161人,其中科技人员63人,中高级职称人员31人。到目前为止,公司已获得授权发明专有技术25项,实用新型专有技术10项。公司专业提供与分离纯化、清洁生产相关的工艺技术开发和综     

华重楼内生菌Iun35的分离及其抗菌蛋白的性质

从华重楼(Paris polyphylla Smith var.chinensis)块茎中分离纯化得到一株具有较强抑菌活性的内生细菌Iun35,经形态特征、生理生化特性及16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将分离得到的Iun35菌株发酵培养,培养液上清经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白UD35.用该蛋白对多种植物病原菌进行拮抗测定,结果显示,UD35对玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuha)、小麦赤霉病菌[Gibberelle zeae(Schw.)]等多种菌有强烈抑制作用.测定其相对分子质量约为55 000,氨基酸分析结果表明其由17种氨基酸组成.图3表4参16     

不锈钢毡电极MEC甲烷原位纯化及原理

为实现有机废弃物能源化利用,采用不锈钢毡电极微生物电解池(MEC)处理含乙酸的模拟废水,系统地研究了外加电压对乙酸去除、甲烷(CH4)生成、微生物种群和活性等方面的影响.结果表明,MEC(0.4 V)中乙酸去除速度最快,可以达到(167.30±0.71)mg·L~(-1)·h-1;MEC(1.0V)中CH4浓度、CH4产生速度和乙酸去除率达最大值,分别为96.98%±1.19%、(1.18±0.04)LMet·d-1·LR-1和100%±0.05%.另外,外加电压可提高阴极微生物代谢活性和嗜氢产甲烷菌的相对丰度.外加电压为1.0 V时,嗜氢产甲烷菌相对丰度达78.87%,其中Methanospirillum最为丰富,其含量占到全部微生物的68.38%.研究证明MEC可以实现乙酸的快速去除、甲烷高效制备和甲烷原位纯化.     

微囊藻毒素［Dha7］MCRR的制备及鉴定

以野外收集的水华蓝藻为原料,经过75％甲醇溶液浸提,快速色谱分离和半制备色谱纯化,从滇池水华蓝藻中分离纯化出1种微囊藻毒素变体。电喷雾质谱、紫外分光光度计和HPLC检测结果表明,所得毒素为[Dha7]MCRR,是MCRR的1种去甲基化变体,其纯度大于 95％。该毒素的分子组成为环(Ala-Arg-MeAsp-Arg-Adda-Glu-Dha),分子量为1023,其紫外扫描光谱（200～300nm）在239nm处有特征吸收。[Dha7]MCRR在滇池水华蓝藻中普遍存在,有时会成为MC的主要种类。