苏云金芽胞杆菌YBT-1520中SigL及其增强子结合蛋白的结构与功能分析

为揭示SigL及其增强子结合蛋白(EBPs)在苏云金芽胞杆菌(Bt)中的调控功能,在全基因组测序的基础上,采用生物信息学方法,对YBT-1520菌株的SigL及其EBPs的结构和功能进行深入分析.结果表明,YBT-1520基因组中存在1个SigL和6个EBPs,而且EBPs在结构上具有丰富的多样性,包含了EBPs的所有可能的结构域组织类型.SigL所调控的基因涉及11个假定的COG代谢途径,其中包括能量代谢、氨基酸代谢、翻译与细胞周期等.根据EBPs在基因组的位置推测,YBT-1520的EBPs参与γ-氨基丁酸代谢途径、精氨酸代谢途径、支链脂肪酸降解途径、多糖分解代谢等代谢途径的调控.本研究将为揭示Bt杀虫晶体蛋白大量表达的调控机制提供新的思路.     

大肠杆菌植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨植酸酶的结构与功能,研究了来源于大肠杆菌的植酸酶基因在酵母中的表达和纯化条件.将含有大肠杆菌植酸酶基因的毕赤酵母工程菌在不同甲醇浓度和不同诱导时间下培养,检测植酸酶的表达情况.结果表明:诱导培养基中一次性添加2.5%的甲醇,诱导96 h后,蛋白浓度达到1.36 mg mL-1,酶活力达到6 530 U mL-1;将在毕赤酵母中表达的植酸酶粗酶液经过硫酸铵盐析、Resource S柱和Superdex-75三步纯化,得到单峰纯的蛋白,比活力为137 280 Umg-1.用圆二色谱分析纯化后的蛋白在pH 5.0和8.0环境中的结构变化,结果显示pH 8.0环境使大肠杆菌植酸酶发生了变性.图3参16     

角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达

以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789),在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中获得了高效表达.该基因全长1146bp,GC含量46.5%,编码381个氨基酸,与已报道的枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.: EU362730)同源性达到100%.重组菌株经IPTG诱导后角蛋白酶酶活力达14.8U/mL,经His-Tag纯化和SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量约为60kDa(融合了硫氧还蛋白,Trx).重组角蛋白酶最适反应温度和pH值分别为65℃与7.0.     

多氯联苯暴露对食蚊鱼CYP19ɑ 和VTGɑ 基因的表达及骨骼形态雄性化的影响

应用食蚊鱼细胞色素P450芳香化酶基因(CYP19%)和卵黄蛋白原基因(VTG%)m RNA转录水平为指标,研究微量多氯联苯(PCBs)长时间暴露对成年雌性食蚊鱼CYP19%基因和VTG%基因表达的影响,并评价其对雌性食蚊鱼产生的形态雄性化效应。采用静水暴露实验模式,分别设置0.08、0.4、2和10μg·L-1PCBs浓度,并设置对照组和平行组,定量测定14 d和28 d性腺CYP19%和肝脏VTG%m RNA表达水平的变化,以及对椎体脉棘发育的影响。暴露实验结果显示:1各PCBs浓度组(0.08、0.4、2和10μg·L-1PCBs)暴露均能抑制食蚊鱼CYP19%和VTG基因的表达,表明PCBs对食蚊鱼VTG%基因的抑制远大于对食蚊鱼CYP19%基因的抑制;20.4μg·L-1PCBs暴露显著地降低了食蚊鱼第15椎体脉棘的长度并降低第15、16椎体脉棘的L/D值,显示食蚊鱼出现骨骼形态雄性化,表明一定浓度的PCBs暴露会表现出抗雌激素效应。     

玉米内生固氮菌的回接分离及限菌条件下在玉米根内的定殖

对从玉米茎内分离的18株固氮菌进行了回接分离试验,经多碳源无氮培养基、菌落形态、颜色与REP－PCR相结合的方法,筛选、鉴定出了两株具有较高乙炔还原活性和能在玉米体内定殖的菌株R1和R6。把携带gfp标记基因的质粒pKK223-GFP和nifH-gfp的质粒pMGFP2.1分别转化R1和R6,得到携带gfp,且菌落带绿色荧光的转化子R1A和R6A,以及携带nifH-gfp的转化子R1B和R6B。在限菌条件下对R1A和R6A,在玉米根内的定殖以及R1B和R6B中nifH-gfp融合基因的表达进行了研究,结果表明了R1A和R6A主要定殖在根的皮层细胞、胞间隙、中柱细胞和导管内,有时在活的细胞内也可检测到,R1B和R6B中的融合基因因受玉米根内营养以及其它与固氮酶基因表达相关因素的限制,很难在玉米根内表达,只有在添加了1‰蔗糖后,nifH-gfp才能在根内表达。     

蚯蚓体内过氧化物还原蛋白PRDX基因对土壤PAHs污染胁迫的转录响应

在前期建立的苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,BaP)诱导上调表达的蚯蚓cDNA文库中,发现一种过氧化物还原蛋白peroxiredoxin6(PRDX6)基因片段,并提交到GenBank.Blastx比对与基因进化分析结果表明,该序列与已知PRDX6的最高相似率为86%,期望值为4E-30.序列分析表明,该序列具有PRDX6基因含Cys编码的一个特征motif,表明该序列属于PRDX6基因.为进一步验证蚯蚓PRDX6基因对多环芳烃污染的响应情况,使用OECD推荐方法,进行了土壤菲、芘、荧蒽和苯并芘污染对蚯蚓的毒性响应的试验(周期28 d),并采用定量PCR方法,检测了各实验组蚯蚓PRDX6基因的表达差异.结果发现,1.0 mg·kg-1的芘和苯并[a]芘均可显著上调蚯蚓PRDX6基因的表达,表明PRDX6基因可作为土壤污染引起蚯蚓抗氧化应激检测的分子标记.     

抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体的表达及鉴定

前期采用核糖体展示技术筛选了抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)高亲和力单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)GX13、GX44和GX95,为高效表达具有生物活性的单链抗体,本研究将前期筛选的高亲和力单链抗体基因转入大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达,点印迹和Western印迹检测可溶性单链抗体的表达水平,亲和层析纯化表达的单链抗体,酶联免疫吸附法(ELISA)检测纯化单链抗体的抗原结合活性.结果显示,3株抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体在大肠杆菌HB2151中均获得成功表达,表达产物分子量(Mr)约为32.0×103,主要集中于细菌周质腔中.ELISA检测纯化的单链抗体都具备抗原结合活性,可进一步应用于柑桔溃疡病菌的免疫诊断和病害防治.图4参14     

Enhancement of MK-7 synthesis by engineered strains of Bacillus subtilis natto that overexpress men genes and by increasing available dissolved oxygen北大核心CSCD

In recent years, researchers have discovered novel physiological functions of vitamin K2. In addition to promoting blood clotting, it can prevent osteoporosis and cardiovascular disease and is expected to treat some tumors and Parkinson’s disease. Bacillus subtilis natto is a probiotic that has been approved by the U.S. Food and Drug Administration for use as a bioproducer of vitamin K2. Its product’s main form is MK-7, which has a long half-life in the human body and high bioavailability. Bacillus subtilis natto displays great potential for large-scale biological preparation of vitamin K2. In this study, the Sipizizen method of Bacillus subtilis transformation was optimized to make it suitable for molecular transformation of Bacillus subtilis natto. Vectors for overexpression of all 8 genes involved in the menadione synthetic pathway were constructed, and changes in MK-7 fermentation yield after transformation of Bacillus subtilis natto were investigated. Three enzymes were found to exert significant effects on MK-7 synthesis, namely isopentenyltransferase (MenA), 1,4-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA synthase (MenB), and nornaphthoquinone methyltransferase (MenG). A modified strain (BN-pABG) with higher MK-7 productivity was obtained by concerted overexpression of menA, menB, and menG. In a 5 L bioreactor, MK-7 synthesis was further enhanced by optimizing oxygen supply. The final yield of MK-7 from the modified strain was 62.21 mg/L, 1.26 times higher than that of the original strain. These results show that combined overexpression of menA, menB, and menG strongly promotes MK-7 synthesis by Bacillus subtilis natto, and optimizing the oxygen supply conditions also promotes more robust MK-7 synthesis. © 2022 Authors. All rights reserved.     

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bgl Ⅰ的全长序列,cDNA序列为2 672 bp.Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOXI基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGER测得该重组蛋白相对分子质量(M)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2 U/mg,小规模发酵量达0.45 mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30 min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH 3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.图6表1参22     

gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10