极端嗜热菌海栖热袍菌木聚糖酶B的克隆和表达

极端嗜热菌海栖热袍菌MSB8(ThermotogamaritimaMSB8)能够利用木聚糖代谢 ,并具有两个产木聚糖酶的基因 .本研究首次克隆和在大肠杆菌中表达海栖热袍菌MSB8的第 2个木聚糖酶基因即xynB基因 .以基因组DNA为模板 ,根据xynB基因的全序列设计了两对引物 ,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB基因片段 .选用pET2 8a(+)表达载体 ,NcoI-HindⅢ酶切位点并编码了羧基端 6×His标签的阳性克隆表达成可溶且具有生物活性的蛋白质 .xynB结构基因由 10 4 4对碱基组成 ,编码 347个氨基酸 .根据已知木聚糖酶蛋白质氨基酸的同源性分析 ,XynB与T .sp.strainFjSS3-B .1的XynA的同源性最大 ,为 85 % ,与T .neapolitana的XynB同源性次之 ,为 82 % ,与其它木聚糖酶的同源性小于 4 3% .另外 ,XynB属于F/ 10族木聚糖酶 ,且含有单一功能区 .表 3图 3参 12     

城市景观水体头孢噻肟耐药菌的β-内酰胺酶类抗性基因接合转移特性

抗生素抗性基因的水平转移是细菌耐药性传播的重要方式.为了解城市景观水体中细菌的抗生素抗性基因水平转移状况,利用从西安市5处景观水体分离得到的216株头孢噻肟耐药菌作为备选供体菌,以大肠杆菌NK5449作为受体菌进行接合试验,测定接合转移频率.采用PCR技术分析可发生接合转移的供体菌株质粒上3种β-内酰胺酶类抗性基因（bla_CTX-M、bla_TEM、bla_SHV）和I型整合子整合酶基因（intI）的分布.同时,采用RT-PCR技术确定这些供体菌株中编码外膜蛋白基因（ompA、ompC、ompF）和接合转移相关基因（trbC、traA、trbBp、traF、trfAp、traJ、korA、korB、trbA）的mRNA表达情况.结果表明,共筛选出12株可发生接合转移的头孢噻肟耐药菌,分别被鉴定为大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌和维氏气单胞菌,接合转移频率为3.95×10^-8~3.07×10^-3.在这12株供体菌株的质粒上,β-内酰胺酶类抗性基因bla_CTX-M、bla_TEM、bla_SHV的检出率分别为58.33%、58.33%、8.33%,I型整合子的检出率为100%.外膜蛋白基因（ompA、ompC、ompF）、性菌毛编码基因（trbC）和供受体菌接合配对形成调控基因（trbBp）在这些供体菌中mRNA表达活跃.     

来自Bacillus circulans WZ-12的二氯甲烷脱卤酶基因dcmR的克隆和表达

通过PCR方法从Bacillus circulans WZ-12中分离到二氯甲烷脱卤酶基因dcmR,构建具T7强启动子的pET28b(+)-dcmR质粒,电击转化Escherichia.coli BL21(DE3),构建了二氯甲烷生物降解基因工程菌BL21[pET28b(+)-dcmR].重组菌经IPTG诱导后,表达蛋白占总蛋白的32%.表达蛋白的酶活最高可达25.78 U/mL,酶的比活(以蛋白计)为88.86 U/mg.重组菌周质中酶活2.92 U/mL,胞内酶活22.86 U/mL.重组菌产生的酶的活力和比活较原降解菌株高1~2倍.对工程菌的生长特性和降解特性的研究表明,工程菌在LB培养基中的生长特性与原始菌株没有差别,生长至对数期A600 nm值都可达2.4左右.重组菌株dcmR-1在25 h的降解率达90%以上,降解效率比原降解菌株有明显提高.该基因工程菌的构建对二氯甲烷生物降解机制研究以及复合污染环境的生物修复和工程应用具有实际意义.     

用单个特异引物扩增桃ACC氧化酶cDNA及其在大肠杆菌中的表达

用单个特异引物和通用引物ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５从桃受伤叶片ｃＤＮＡ中扩增出１．３ｋｂ左右大小的片段．将该扩增产物克隆并对重组克隆作酶切分析发现至少可分为３类．用桃ＡＣＣ氧化酶基因组ＤＮＡ为探针进行点杂交表明,４,７,９,１０,１１,１２重组质粒能与之杂交,其中７,９,１０,１１,１２号重组质粒酶切图谱与已报导的桃果实成熟相关的ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ基因基本一致,而４号克隆则不同．ＤＮＡ序列分析和ＰＣＲ鉴定表明,插入片段均由５′端特异引物单个引物扩增出来,对７号重组克隆插入片段ＤＮＡ全序列分析表明,７号重组克隆插入片段全长１１４６ｂｐ,包含了除启始密码子外的全部编码区和１９２ｂｐ的３′端非编码区．通过补上起始密码子ＡＴＧ构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达出３５×１０３的非融合蛋白     

三唑磷作用下翡翠贻贝抑制性消减杂交文库构建与分析

采用抑制性差减杂交技术,构建了三唑磷农药急性胁迫下翡翠贻贝雌贝性腺正反向消减杂交cDNA文库.正反向文库共有117个表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）与NCBI数据库中已知功能蛋白具较高同源性,假定蛋白12种,另有195个ESTs未检索到同源序列.正向文库中含有细胞周期蛋白、性激素合成蛋白、DNA修复蛋白、能量代谢相关蛋白等一系列与生殖、应激适应和代谢相关的转录本信息,而反向文库中的差异ESTs主要涉及DNA复制、转录和翻译调控基因以及骨架蛋白.结果表明三唑磷对翡翠贻贝的毒性涉及到生殖调控、能量代谢、应激适应、转录翻译调控等生理代谢的多个方面,正向文库中发现的几种生殖调控基因（细胞周期蛋白、周期蛋白依赖性蛋白激酶、合子DNA复制许可因子、精子特异性蛋白、雌激素硫酸转移酶和卵黄膜卵透明带域蛋白）可能是三唑磷生殖干扰毒性作用过程中的关键基因,这为有机磷农药的生殖毒性探索提供了基础数据.     

草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因可变剪接体克隆与表达分析

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是磷酸戊糖途径的限速酶,影响着细胞生命活动所需要的NADPH的产生.为揭示草菇菌丝生长的分子基础,通过克隆草菇6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因(6gpdh)的可变剪接体,测序后进行生物信息学分析,利用表达谱和qPCR测定了它们在同核体和异核体菌株的表达量.结果显示,草菇6gpdh序列全长2 315bp,含10个内含子,第6个内含子存在内含子保留的可变剪接.在同核体和异核体菌株中,内含子保留的可变剪接体表达量低,且菌株间没显著差异,而内含子被剪接的剪接体表达量高,且异核体菌株高于同核体菌株.两种可变剪接体具有6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶保守结构域和相似的三维结构.因此,初步分析两个可变剪切体是同工酶,内含子保留是组成型表达,表达量与菌丝生长快慢无关,内含子剪接是主效剪接方式,菌丝生长快的菌株表达量高,生长慢的菌株表达量低.图6表1参26     

甘薯LEA2基因的克隆与表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关,研究LEA家族基因对于甘薯抗逆性分子育种具有重要意义.通过对甘薯(徐薯18)转录组数据库搜寻时发现编码LEA2的转录本,随后对该转录本进行了克隆和测序分析,利用数字表达谱(Digital Gene Expression Profi ling,DGE)和半定量RT-PCR分析了Ib-LEA2在不同组织和不同发育阶段的表达图谱.为进一步了解Ib-LEA2在生物体响应盐胁迫中的作用,将Ib-LEA2连接原核表达载体pET-32a,用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行盐胁迫的耐受分析.结果显示:Ib-LEA2完整的开放阅读框(ORF)长度为942 bp,编码313个氨基酸残基.进一步研究发现,在甘薯组织内同时存在3个高度同源的LEA 2基因型(核苷酸序列99%),分别命名为Ib-LEA2a、Ib-LEA2b和Ib-LEA2c.数字表达谱和半定量RT-PCR的结果显示Ib-LEA2在不同组织和发育阶段具有不同的表达图谱,在茎中的表达量远远高于叶和根.大肠杆菌BL21(DE3)菌株盐胁迫的结果显示,较之对照菌株,表达Ib-LEA2的菌株能够更好地耐受高浓度的NaCl.研究表明,Ib-LEA2对盐胁迫有一定的响应能力,能够保护细胞免受高盐的毒害.     

杂合抗菌肽LPCB在毕赤酵母中的表达条件优化

为获取能表达具有天然活性的杂合抗菌肽的重组酵母菌,确定其最佳表达条件,将构建好的重组酵母表达载体pPICZα-A-CecropinB(1～10)-Magainin2(1～12)(简称pPICZα-A-CBMA)和pPICZα-A-Lfcin-Pro-CecropinB(简称pPICZα-A-LPCB)经SacⅠ线性化处理,分别电转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,PCR扩增验证,甲醇诱导表达.采用抑菌圈法初步测定产物活性,优化杂合肽LPCB诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度、培养基pH等表达条件,传代检测其质粒稳定性.结果显示,基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-CBMA和P.pastoris X-33/pPICZα-A-LPCB成功构建.表达产物前者抑菌活性微弱,后者抑菌活性良好.杂合肽LPCB的最佳表达条件为:25℃,pH中性培养,每24 h添加0.5%(V/V,φ)甲醇,诱导表达72 h.重组酵母菌pPICZα-A-LPCB在培养超过100代后,未发生质粒丢失.     

番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

大气细颗粒物对小鼠T淋巴细胞亚群的影响

大气颗粒物对肺免疫系统有潜在毒性作用,打破免疫系统平衡,大气颗粒物成分中危害首当其冲的是大气细颗粒物(PM_(2.5)),为研究大气细颗粒物引起的机体T淋巴细胞中Th1/Th2免疫失衡方向。本研究通过免疫组化实验方法检测暴露后小鼠肺组织中T淋巴细胞的表达,进一步采用流式细胞术检测大气细颗粒物气管滴注后小鼠肺脏淋巴细胞中Th1/Th2比例。暴露组小鼠肺组织免疫组化研究结果提示浸润细胞区有大量的CD4~+T细胞,中高剂量暴露组小鼠肺组织中淋巴细胞亚群Th1/Th2比例向Th1偏移。大气细颗粒物影响免疫失衡,使T淋巴细胞向Th1漂移。