豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化

将含有和不含前肽的豆豉溶栓酶编码序列在毕赤酵母中分别进行表达研究,发现在含有前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母工程菌用甲醇诱导时,其培养液中可检测到较强的溶栓酶活性;而在不含前肽的豆豉溶栓酶基因转化的毕赤酵母菌用甲醇诱导时,培养液中未检测到溶栓酶活性.对毕赤酵母表达和分泌的豆豉溶栓酶进行了分离纯化,并对其纯化产物进行溶栓酶活性、SDS-PAGE电泳、抑制剂作用及免疫印迹分析.结果表明,分泌到培养液中的豆豉溶栓酶已经过剪切加工,其前肽已被切除,重组与天然的豆豉溶栓酶具有相同的溶栓酶活性,其所测定的各理化指标均一致.本研究实现了豆豉溶栓酶在毕赤酵母菌中成功表达,并首次直接证明了前肽对豆豉溶栓酶在毕赤酵母中分泌表达是必须的.图3表1参20     

粘红酵母(Rhodotorula glutinis CIBAS A 1401)苯丙氨酸解氨酶cDNA核心序列的克隆与分析

L苯丙氨酸因其在工业、医药上的重要作用而日益受到人们的重视.苯丙氨酸解氨酶(PAL)生物转化肉桂酸生产L苯丙氨酸成了该领域研究与开发的热点.本文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法,从粘红酵母中克隆了苯丙氨酸解氨酶cDNA核心序列,为克隆其cDNA全长序列及体外表达其活性蛋白奠定了基础.图5参22     

含硫酸盐高有机物浓度酵母生产废水两相厌氧处理

采用“铁床＋产酸相＋空气吹脱＋产甲烷相”相串联工艺处理富含硫酸盐的高浓度酵母生产废水，实现了硫酸盐及有机物有效去除的双重目标。     

Candida utilis生物合成谷胱甘肽的营养及环境条件

研究了摇瓶条件下Candida utilis WSH02—08生物合成谷胱甘肽(GSH)的营养条件，确定以葡萄糖作为碳源，硫酸铵和尿素作为混合氮源．在L6(4^5)正交试验的基础上，选用BP神经网络对营养条件进行优化和预测，得出较优的营养组合为：葡萄糖30gL^-1(NH4)2SO4gL^-1，尿素4gL^-1，KH2PO4 3gL^-1，MgSO4 0．25gL^-1．研究了GSH发酵的环境条件，得出较优的组合为：初始pH6．0，装液量30mL／250mL，接种量10％．利用优化后的营养及环境条件进行摇瓶发酵实验，结果表明，GSH产量和细胞干重均有较大幅度的提高．图7表2参13     

T—2毒素与硒对酵母生长的影响及其拮抗作用

通过培养产朊假丝酵母比较RNA与蛋白含量的变化,评价加入培养基中的T-2毒素与硒的细胞毒性和生理活性.试验表明,5ppm T-2毒素明显抑制产朊假丝酵母的生长,1ppm硒对生长的促进作用显著,且可完全拮抗5ppm T-2毒素的毒性.     

酵母融合菌-活性污泥曝气处理含镍废水研究

利用酵母融合菌RJ与活性污泥曝气处理含镍废水.实验结果表明,融合菌对废水中的镍具有很强的富集性能,投加10g/L菌体,处理20 mg/L含镍废水,去除率可达70.10%;同时投加6g/L活性污泥,去除率上升到80.73%,出水固液分离效果得到改善;且融合菌的pH值适用范围较广,当pH=3～9时,去除率均在75%以上;溶解氧是影响曝气生物吸附的重要因素,在缺氧或富氧环境下,生物吸附会受到抑制,DO为2.5～4.5 mg/L时吸附效果较好;融合菌-活性污泥曝气处理不同浓度Ni2 的吸附等温线符合Freundlich模型,相关系数为0.997 5.     

复合诱变原生质体选育重金属去除菌

选用紫外线和亚硝酸对产朊假丝酵母CR-001进行单因子和多因子诱变处理,通过复合诱变得到了6株具有高重金属抗性的高效重金属去除菌.经过传代后CRC2811-1和CRC7-2的抑菌圈直径减至1.7mm和1.2mm;对Cr⁶⁺的去除率分别从80.2%和81.2%提高到了95.2%和94.7%.其余4株突变株的抗性和除铬性能均可保持稳定.此外,利用扫描电镜、透射电镜和原子力显微镜等仪器对吸附铬前后细胞内外的变化情况进行分析,探讨了突变菌株除铬性能改善的机理.     

水稻RBX1基因cDNA的分离及其过量表达载体对水稻的转化

RBX1蛋白是基于Cullin蛋白的E3复合体中的一个亚基,对于基于Cullin蛋白的E3复合体结合E2及Cullin蛋白的活化具有重要作用.利用RT-PCR分离到水稻RBX1cDNA,序列比对分析显示,水稻RBX1与拟南芥、人、果蝇及酵母中该同源蛋白的氨基酸序列一致性分别为80%、74.4%、72%和51.2%.酵母双杂交实验显示,水稻RBX1与水稻Cullin4蛋白有着相互作用.将水稻RBX1cDNA插入植物表达质粒pHB,利用农杆菌介导法将构建好的植物表达载体导入水稻,获得植株38株.以基因组DNA为模板对潮霉素抗性基因片段进行扩增,初步确定其中32株为转基因植株.图5表1参17     

基于途径分析促进α-酮戊二酸过量积累的数学模型技术

在详尽分析α-酮戊二酸(α-KG)合成途径的基础上,结合数学模型,对光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019过量合成α-KG的合成途径及其调控因素进行全面分析与优化.全因子实验表明,硫胺素(B1)和CaCO3是影响α-KG过量积累的关键因素.在此基础上,采用最速上升实验得到α-酮戊二酸积累的最大响应区域为B10.016 mg/L、CaCO3 84 g/L附近.采用中心组合设计及响应面分析确定最优培养基组分为:硫胺素(B1)0.02 mg/L、生物素(Bio)0.05 mg/L、CaCO3 82 g/L和乙酸钠4 g/L.在最优培养基中,α-KG产量达到26.8 g/L,提高了34%.α-酮戊二酸发酵过程动力学分析表明,采用最优培养基使发酵延滞期缩短6 h,菌体比生长速率和α-KG比产物生成速率分别提高了45.4%和8.64%.图2表3参12     

酵母双杂交技术构建稀有鮈鲫不同雌激素受体亚型的重组荧光酵母

目前关于环境雌激素(environmental estrogens,EEs)的效应评估大多数是基于人的雌激素受体(estrogen receptor,ER)的离体检测,缺乏EEs对鱼类ER影响的研究。本研究利用酵母双杂交技术构建模式生物稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母,用以快速检测EEs的雌激素活性并研究不同ER亚型对17β-雌二醇(E_2)敏感度的差异。采用反转录多聚酶链反应法获取稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2的配体结合域(LBD)序列,构建并鉴别诱饵质粒pGBKT7-ERα-LBD、p GBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD。将诱饵质粒和猎物质粒pGAD424-GRIP1同时转化荧光酵母Y187-Luc,分别构建3株稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母,并考察了E_2、双氢睾酮(DHT)、9-顺维甲酸(9-cis RA)、三碘甲状腺原氨酸(T_3)和孕酮(PG)对荧光素酶的诱导情况。结果显示:ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母能够专一性地被E_2诱导产生荧光素酶,并存在显著的剂量-效应关系,半数效应浓度(EC_(50))值分别为1.98×10~(-9)、1.77×10~(-10)、和3.52×10~(-10)mol·L~(-1),对E_2的敏感程度排序为:ERβ1-GRIP1>ERβ2-GRIP1>ERα-GRIP1。研究表明,稀有鮈鲫不同ER亚型对E_2的响应具有差异,3株重组荧光双杂交酵母不仅可以应用于快速识别内分泌干扰物中的类雌激素物质,分析稀有鮈鲫不同ER亚型对EEs的敏感性,解析雌激素污染物对稀有鮈鲫的作用机制,评估鱼类接触EEs的潜在风险,以期为水质保障和污染治理提供重要依据。