腺病毒气溶胶的实时荧光定量PCR检测和绿色荧光蛋白活细胞检测

将带有绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,作为模拟病毒建立一种检测病毒侵袭力的方法.在钢化玻璃箱中通过TK-3型微生物气溶胶发生器将腺病毒形成气溶胶,用FA-1型多级撞击式空气微生物采样器进行气溶胶采样,对采样样品分别进行实时荧光定量PCR检测和表达了绿色荧光蛋白的PK15活细胞定时检测.实时荧光定量PCR检测可测定病毒在大气中存在的相对基因拷贝数,通过在荧光显微镜下计数带绿色荧光的PK15细胞数可直观检测病毒的感染力及活力.结果表明,重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器第五级,腺病毒气溶胶与病毒粒子相比较大.     

固态发酵过程中微生物总DNA提取方法比较

为了分析固态发酵过程中微生物群落的多样性及演替情况,对比研究了从固态发酵中提取细菌和真菌DNA的3种方法--溶壁酶法、超声波法、液氮研磨 CTAB法.使用紫外分光光度计测定了由不同提取方法得到的DNA的产量与纯度;使用细菌16S rDNA基因通用引物(341F和907R)和真菌18S rDNA基因通用引物(NU-SSU-0817和NU-SSU-119)对DNA进行了PCR扩增;采用DGGE(变性梯度凝胶电泳)法对固态发酵中细菌和真菌的多样性进行了分析.结果显示,3种方法得到的粗提和纯化DNA长度均约为23 kb;细菌和真菌PCR产物长度分别约为586 bp和422 bp.细菌和真菌PCR产物的DGGE分析表明,3种方法提取的DNA所反映的微生物多样性比较一致;但紫外分光光度计测定结果表明溶壁酶法提取固态发酵中微生物总DNA产量最高,超声波法次之,液氮研磨 CTAB法最低.     

食品企业污水中细菌的基因芯片快速检测技术

食品企业污水中含有各种无机污物和有机污物．其中夹带的致病菌将导致多种疾病的爆发和流行．严重威胁着人类的健康。传统的细菌分离、培养和鉴定技术操作繁琐且耗时长（一般需4～7d）。为了快速．准确地检测食品企业污水中存在的细菌，建立了一种采用基因芯片技术对食品企业污水中常见细菌检测和鉴定的实验方法（需时4h）。实验中设计了8对特异引物并成功分成2组混合引物进行多重PCR反应：BI物Ⅰ为Kp＋HlyA＋InvA＋ipaH，引物Ⅱ为Cadc＋Oprl＋Ent＋23SrRNA。效果良好。实验确定了适宜的PCR反应循环数为35个循环，适宜的杂交温度为48℃。用实验制备的基因芯片对模拟水样检测结果的准确率达100％，说明该基因芯片对目的细菌特征基因的检测结果是可靠的。用该方法对食品企业污水水样进行检测具有高准确率，为今后更大规模的检测研究奠定了基础。     

紫外线和次氯酸钠对Escherichia coli和Poliovirus的消毒作用

本研究选用大肠杆菌(Escherichia coli)和脊髓灰质炎病毒(poliovirus)分别作为典型的细菌和病毒,利用培养和定量PCR的检测技术,对比研究紫外线消毒和次氯酸钠消毒对细菌和病毒的作用特点.结果表明:脊髓灰质炎病毒比大肠杆菌更难被灭活,达到1-log所需的氯剂量分别为19.2 mg·L~(-1)·min和10.14 mg·L~(-1)·min;所需的紫外线剂量分别为6.37 m J·cm~(-2)和1.81 m J·cm~(-2).定量PCR方法检测大肠杆菌和脊髓灰质炎病毒达到1-log的核酸损伤所需的紫外线剂量和氯剂量要比培养法高出1~2数量级,紫外线消毒对脊髓灰质炎病毒的RNA损伤量明显大于对大肠杆菌的DNA损伤,病毒的单链RNA对紫外线的敏感性更强,该结果与培养法正好相反.达到1-log核酸损伤脊髓灰质炎病毒所需的紫外线剂量为135 m J·cm~(-2),大肠杆菌所需的剂量为270.3 m J·cm~(-2),核酸损伤需要更多的消毒剂量,可能由于消毒过程微生物进入活性但处于非可培养状态(VBNC),以及灭活对微生物其他分子的损伤和微生物死后核酸的持续性.     

垃圾填埋场抗生素抗性基因初探

不同环境介质中抗生素抗性基因普遍存在,但是在垃圾填埋场中抗生素抗性基因尚无相关报道.本实验以西安江村沟垃圾填埋场为研究对象,采集不同方位不同深度垃圾样品,分析垃圾理化性质,用荧光定量PCR检测磺胺类抗生素抗性基因(sulⅠ和sulⅡ)、抗氯霉素类抗生素抗性基因(cat)、β-内酰胺类抗生素抗性基因(bla-SHV),以及四环素类抗生素抗性基因(tet W)等5种抗生素抗性基因的含量,以相关性分析垃圾理化性质与抗性基因的关联.结果表明,5种抗生素抗性基因均存在于垃圾中,基因拷贝数(以干土计)最大值分别为:(3.70±0.06)×108copies·g-1(sulⅡ)、(9.33±0.06)×106copies·g-1(sulⅠ)、(2.27±0.08)×105copies·g-1(tet W)、(3.68±0.09)×104copies·g-1(bla-SHV)和(1.39±0.10)×104copies·g-1(cat),说明垃圾填埋场是抗生素抗性基因潜在的储存库.抗性基因sulⅠ、sulⅡ和cat与含水率呈明显的正相关,同时sulⅠ和cat基因含量与p H值呈负相关.     

纤维载体的生物膜CANON反应器的启动特性

为研究纤维载体在CANON工艺中的运行特性,同时接种亚硝化污泥及厌氧氨氧化污泥启动CANON反应器.结果表明经过85 d运行,成功启动了CANON反应器,NRR从0.09 kg·(m3·d)-1提升至0.9 kg·(m3·d)-1并能稳定运行,说明纤维载体有利于富集污泥,反应器内能维持较高的生物量.随着微生物的富集生长,生物膜变厚,反应器的能力提升,反应器中DO达到5 mg·L-1.利用微电极测得生物膜由表及里的DO梯度为0.32~0 mg·L-1,说明生物膜变厚,氧对生物膜的穿透力减弱,亚硝化微生物量降低.荧光定量PCR结果表明,启动前后NOB菌数量维持在较低水平,AOB菌的丰度增长不大,ANAMMOX菌细胞增长了一个数量级.     

城市地表水中肠道病原微生物与粪便污染指示菌的关系研究

本研究选择肠道病毒、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌作为城市水体中典型的肠道病原微生物,分别建立起相应的实时荧光定量PCR检测方法.对水源水、景观娱乐用水以及城市河流样品进行长期监测,考察典型肠道病原微生物的分布特征和变化规律.肠道病毒在各地表水体中都有检出,浓度大都在103copy·L-1以下.大肠埃希氏菌的含量在保护良好的水体和接纳城市污水的水体中有明显差别,而伤寒沙门氏菌和志贺氏菌通常出现在受粪便污染较重的水体中.统计学的分析结果显示各种水体中的肠道病原微生物检出浓度均符合对数正态分布规律.粪便污染指示菌与肠道病毒之间不存在显著的相关性,但却能在一定程度上反映典型肠道病原菌的存在情况.在大肠菌群或粪大肠菌群浓度为104CFU·L-1以上的样品中,伤寒沙门氏菌、志贺氏菌具有较高的阳性率.     

磺胺甲(口恶)唑污染土壤中微生物群落结构与抗生素抗性基因的分布特征

采用盆栽实验模拟磺胺甲■唑污染,通过Illumina高通量测序研究了土壤微生物群落组成的变化,应用普通PCR和微滴数字PCR技术分析了6种抗生素抗性基因的64个抗性基因亚型的分布特征.结果表明,土壤受不同浓度磺胺甲■唑污染120 d后,土壤真菌的多样性无明显变化(P0.05),但土壤细菌的多样性显著降低了(P0.05),土壤细菌和真菌群落结构均发生显著改变,且不同浓度磺胺甲■唑处理土壤的优势细菌与真菌在属水平上存在明显差异.磺胺甲■唑污染使土壤中抗生素抗性基因的多样性增加,且能显著提高磺胺抗性基因sul1的丰度(P0.05),但对磺胺抗性基因sul2、喹诺酮抗性基因floR与cmlA 1、四环素抗性基因tet(34)、tetG 2、tetG 1、tetM与tetA/P的丰度均无显著性影响(P0.05).     

Verification of Bacteroidales 16S rRNA markers as a complementary tool for detecting swine fecal pollution in the Yangtze Delta

To correctly assess and properly manage the public health risks associated with exposure to contaminated water, it is necessary to identify the source of fecal pollution in a watershed. In this study, we evaluated the efficacy of our two previously developed real time-quantitative PCR (qPCR) assays for the detection of swine-associated Bacteroidales genetic markers (gene 1–38, gene 3–53) in the Yangtze Delta watershed of southeastern China. The results indicated that the gene 1–38 and 3-53 markers exhibited high accuracy (92.5%, 91.7% conditional probability, respectively) in detecting Bacteroidales spp. in water samples. According to binary logistic regression (BLR), these two swine-associated markers were well correlated (P < 0.05) with fecal indicators (Escherichia coli and Enterococci spp.) and zoonotic pathogens (E. coli O157: H7, Salmonella spp. and Campylobacter spp.) in water samples. In contrast, concentrations of conventional fecal indicator bacteria (FIB) were not correlated with zoonotic pathogens, suggesting that they are noneffective at detecting fecal pollution events. Collectively, the results obtained in this study demonstrated that a swine-targeted qPCR assay based on two Bacteroidales genes markers (gene 1–38, gene 3–53) could be a useful tool in determining the swine-associated impacts of fecal contamination in a watershed.     

基于PMA-定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究

建立了一种核酸染料propidium monoazide(PMA)与定量PCR技术联合选择性检测活性病原菌的技术(PMA-qPCR),以大肠杆菌作为模式菌,研究了氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活特性.结果表明,PMA染料能够分别去除99.94%和99.99%的来自非活性大肠杆菌和沙门氏菌的DNA,PMA-qPCR技术能够有效区分活性菌与非活性菌;PMA-qPCR技术得到的氯和一氯胺消毒对大肠杆菌的灭活曲线符合一级动力学方程,灭活速率常数分别为 2.24 L·(mg·min)^-1和0.0175 L·(mg·min)^-1,低于平板培养法得到的灭活速率常数;当大肠杆菌的去除率达到99%时,采用PMA-qPCR技术检测需要的ct值相比于平板培养法从0.6 mg·L^-1·min上升到0.9 mg·L^-1·min(氯消毒)和从20 mg·L^-1·min上升到超过100 mg·L^-1·min(一氯胺消毒);随着ct值的升高,常规qPCR的检测结果基本不变,因此常规qPCR不能够反映氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.作为一种新的表征消毒特性的检测技术,PMA-qPCR技术有助于更为准确地评价氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.