中度嗜盐菌Halomonas sp.BYS-1启动子的克隆和测序

提取了中度嗜盐菌Halomonassp.BYS1的基因组DNA,以甲基对硫磷水解酶基因(mpd)为报告基因,以启动子探针pUCmpd为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建了BYS1的启动子文库.通过筛选获得了17个阳性克隆,编号为P1～P17.测定了阳性克隆的甲基对硫磷水解酶(MPH)活性,结果表明,P3中mpd基因的启动子活性最强,它的酶活高达2554.3U/mg,而P17中mpd基因的启动子活性最弱,它的酶活只有68.3U/mg.对P3、P8、P17克隆中的重组质粒的插入片段进行了测序和在线启动子预测.图4表1参17     

北极新奥尔松地区土壤及沉积物中可培养细菌多样性及分布特征分析

以2010年中国北极黄河站科学考察从新奥尔松地区采集的2个土壤和8个不同类型的沉积物样品为研究对象,采用分离培养方法及16S rRNA基因序列测定分析可培养细菌的多样性。对从10个站位分离出的343株细菌进行菌落特征分析,选取47株代表性细菌进行16S rRNA基因的分子鉴定并构建系统发育树,结果表明47株细菌归属于4个门,6个纲,18个属和29个种。在属水平上,芽孢杆菌纲细菌的多样性最为丰富,共6个属;在菌株数量上,γ-变形菌纲属于优势类群,共27株,分属于13个种。北极新奥尔松地区可培养细菌在海洋沉积物、湖泊沉积物、河流沉积物及土壤中的种属构成存在差异,其中海洋沉积物中细菌多样性最为丰富,而湖泊沉积物中细菌多样性次之。     

油藏内源微生物群落结构特征研究

采集大港油田油井well-1017采出液,利用GC-MS分析油藏原油结构并利用16S r DNA克隆文库技术分析油藏内源微生物群落结构特征,探索极端油藏环境下细菌和古细菌的群落功能。研究结果表明:长期水驱开采导致了油藏采出液含水率、原油重质组分升高,原油品位下降。同时,油藏内源微生物16S r DNA克隆文库系统反映了油藏细菌群落包括Proteobacteria、Firmicutes、Nitrospirae、Bacteroidetes、Thermotogae、Deferribacteres、Caldiserica、Dictyoglomi和Aquificae等9个门类,而古细菌群落主要包括广古菌门Euryarchaeota的Methanobacteria、Archaeoglobi、Methanomicrobia和Thermococci等4个纲结构;微生物文库构成显示极端油藏环境下仍存在着丰富的功能微生物资源,其在石油烃降解、产表面活性剂和产甲烷等方面展现出较大的应用潜力。研究极端油藏微生物群落结构多样性,可以为微生物驱油技术在低品位油藏资源的开采应用中提供重要的生物信息。     

基于Miseq测序与碳平衡的生物滴滤床降解甲苯研究

在甲苯进气浓度为1 640 mg/m3,进气负荷为198.11 g/(m3·h),系统停留时间(EBRT)为30 s的条件下,生物滴滤床对甲苯的去除率达到84%,去除负荷为166.41 g/(m3·h)。碳平衡计算表明:22.27%的输入碳源为微生物所同化,59.52%的碳以CO2形式排出,仅有2.46%的碳溶于营养液中。在出口气体中,以CO2形式存在的碳占79.08%,其余则以甲苯形式存在。经Miseq-16S rRNA测序平台分析可知,该生物反应器中的优势菌属为假单胞菌、丛毛单胞菌和红球菌属,优势菌门为变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门。其中,变形菌门和拟杆菌门在反应器中所占比例在经过驯化之后显示出相反的变化趋势。     

用单个特异引物扩增桃ACC氧化酶cDNA及其在大肠杆菌中的表达

用单个特异引物和通用引物ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５从桃受伤叶片ｃＤＮＡ中扩增出１．３ｋｂ左右大小的片段．将该扩增产物克隆并对重组克隆作酶切分析发现至少可分为３类．用桃ＡＣＣ氧化酶基因组ＤＮＡ为探针进行点杂交表明,４,７,９,１０,１１,１２重组质粒能与之杂交,其中７,９,１０,１１,１２号重组质粒酶切图谱与已报导的桃果实成熟相关的ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ基因基本一致,而４号克隆则不同．ＤＮＡ序列分析和ＰＣＲ鉴定表明,插入片段均由５′端特异引物单个引物扩增出来,对７号重组克隆插入片段ＤＮＡ全序列分析表明,７号重组克隆插入片段全长１１４６ｂｐ,包含了除启始密码子外的全部编码区和１９２ｂｐ的３′端非编码区．通过补上起始密码子ＡＴＧ构建重组表达载体,在大肠杆菌中表达出３５×１０３的非融合蛋白     

环境样品中亚硝酸细菌amoA基因的克隆与测序

对从环境样品中分离的亚硝酸细菌(Ammonia oxidizingbacteria)amoA基因进行克隆与测序,为构建基因工程菌打下基础。采用亚硝酸细菌选择性培养基,从4个不同的畜牧养殖污水处理厂采集的样品(分别编号为1,2,3,4)在室温下富集培养2个月后,采取酚氯仿抽提的方法提取DNA。根据已报道的亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)amoA基因序列,设计引物AMOB AMOE,并在AMOB,AMOE的5′-端分别加上了BamHⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点,以利于进一步酶切和克隆。用AMOB AMOE对4种样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,4种样品中1号和3号样品扩增得到预期长度的DNA片段,2号和4号样品扩增没有得到预期片段。回收纯化PCR产物与pGEM-T载体连接,构建amoA基因测序载体,并转化E.coliM15。测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果显示,扩增得到的DNA片段均与Nitrosomonassp.GH22的amoA基因有99 7%的同源性,可从环境中分离的亚硝酸细菌中克隆出amoA基因。      

浅水湖泊底泥细菌群落的时空分布特征及主要营养盐驱动因素

为探究富营养化浅水湖泊底泥中细菌群落的结构特征及驱动因素,本研究以安徽八里河湖为例,通过16S rRNA高通量测序手段并结合底泥的营养盐理化性质,分析了底泥细菌群落物种组成和多样性的时空分布特征以及与营养盐的相关性关系。结果显示：(1)在物种组成方面,γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和拟杆菌纲(Bacteroidia)是八里河湖底泥中的优势菌纲,它们在空间上呈均质性和在季节上有稳定性;(2)在群落结构方面,底泥细菌群落整体上以季节进行聚类,呈现了季节内的相似性和季节间的差异性,且可能来自于鱼类粪便的Clostridia菌纲在八里河湖底泥细菌群落结构差异的塑造上有重要贡献;(3)从四个季节所有样品的整体角度来看,与磷相关的指标(总磷、铁铝结合态磷、钙磷、有机磷)对细菌群落变化的解释最强(r=0.23～0.45,p<0.001),且底泥细菌群落之间的差异性随各磷指标内部之间差异的增大而增大。本研究的发现为认识和理解富营养化浅水湖泊中底泥细菌群落特征及其驱动因素提供了新的信息,对湖泊生态系统健康状态的监测和评...     

硫铁填料和微电流强化再生水脱氮除磷的研究

为提高再生水质量,在不同C/N和HRT条件下,对比分析硫铁复合填料和微电流作用强化再生水深度脱氮除磷效果.结果表明,硫铁复合填料和微电流作用均能够强化氮、磷的深度去除效果,且二者结合能够使反硝化系统pH值稳定在7.2~8.5之间.系统中TN主要靠异养反硝化、氢自养反硝化和硫自养反硝化作用去除,94.04%的TP是以生成磷酸铁沉淀的形式去除.分别从填料上取生物膜,进行Miseq高通量测序,构建细菌16S rRNA基因克隆文库.结果发现,在仅有海绵铁作用系统中,同时具有异养反硝化和氢自养反硝化功能的细菌所占比例达到29.47%;硫铁复合填料和硫铁微电流作用系统中,具有硫自养反硝化功能的Thiobacillus(硫杆菌属)所占比例分别达到60.47%和40.62%.因此,硫铁复合填料和微电流作用用于强化再生水深度脱氮除磷具有明显的优势.     

三唑磷作用下翡翠贻贝抑制性消减杂交文库构建与分析

采用抑制性差减杂交技术,构建了三唑磷农药急性胁迫下翡翠贻贝雌贝性腺正反向消减杂交cDNA文库.正反向文库共有117个表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）与NCBI数据库中已知功能蛋白具较高同源性,假定蛋白12种,另有195个ESTs未检索到同源序列.正向文库中含有细胞周期蛋白、性激素合成蛋白、DNA修复蛋白、能量代谢相关蛋白等一系列与生殖、应激适应和代谢相关的转录本信息,而反向文库中的差异ESTs主要涉及DNA复制、转录和翻译调控基因以及骨架蛋白.结果表明三唑磷对翡翠贻贝的毒性涉及到生殖调控、能量代谢、应激适应、转录翻译调控等生理代谢的多个方面,正向文库中发现的几种生殖调控基因（细胞周期蛋白、周期蛋白依赖性蛋白激酶、合子DNA复制许可因子、精子特异性蛋白、雌激素硫酸转移酶和卵黄膜卵透明带域蛋白）可能是三唑磷生殖干扰毒性作用过程中的关键基因,这为有机磷农药的生殖毒性探索提供了基础数据.     

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.