地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定

以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb大小的麦芽糖淀粉酶基因amyM,克隆入表达载体pET-28a(+),转化Escherichia.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,测定麦芽糖淀粉酶酶活性.结果表明,麦芽糖淀粉酶基因amyM获得了活性表达,酶活力为3.797 U/mL,SDS-1PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为67×103的特异性蛋白质条带.酶学性质分析表明,重组麦芽糖淀粉酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.5,在45℃以下的中低温环境保持稳定,且能在比较宽的pH范围内(pH 4.5～8.5)稳定.图3表1参16     

含油污泥中石油降解菌的分离及其降解特性

从渤海油田含油污泥中分离出3株石油烃降解菌,通过16S rRNA基因序列鉴定RS1、RS2和RS3分别为棒状杆菌、短杆菌和假单胞菌。经单因素实验确定,3株细菌对石油的最适降解条件分别为37℃、盐度3%、pH 8;32℃、盐度1%、pH 8;42℃、盐度1%、pH 6。降解实验结果表明,3株细菌30 d内对含油污泥中总石油烃的降解率分别为39.69%、31.13%和53.29%,而混合菌的降解效果明显高于单一菌株,降解率为58.08%;不同菌株对原油中不同组分的降解能力不同,其中,RS1对饱和烃的降解率最高,达20.74%,RS3对芳香烃的降解率最高,达到8.08%;GC-MS分析表明,混合菌对n-C12~n-C34等正构烷烃均有明显降解,且对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽等多环芳烃的降解能力较强。     

现代分子生物学技术在动物肠道微生物多样性研究中的应用

现代分子生物技术的蓬勃发展解决了不可培养微生物研究的难题,使得肠道微生物的研究进入一个新的阶段.本文主要介绍了基于16SrRNA的分子分析技术,包括DGGE(变性梯度凝胶电泳),TGGE(温度梯度凝胶电泳),SSCP(单链构象多态性),RFLP(限制性片段长度多态性)等肠道微生物研究工作中常用的分子生物学技术方法、适用范围及可能的发展方向,为动物肠道微生物区系的进一步研究及开发应用提供帮助.表1参42     

水稻花药绒毡层特异表达启动子的分离与表达载体构建

从籼稻川75A(OryzasativaL.)黄化苗叶片中直接提取基因组总DNA.根据文献报道的水稻花药绒毡层特异启动子Osg6B序列设计引物,采用TouchdownPCR技术获得水稻花药绒毡层特异表达的启动子Tsp1,将该片段克隆在载体pMD18-TVector上转化到大肠杆菌JM109,并酶切和PCR验证.序列分析发现,该片段与Osg6B启动子同源性为96%,且具有真核生物启动子的多种特征序列,表明启动子Tsp1为来源于籼稻川75A中的水稻花药绒毡层特异表达的启动子.利用该启动子对本实验室保存的质粒pIB467和pIB009进行改造,构建了一个可产生新型雄性不育系的双元植物表达载体pJH401.图7参13     

生物对得克隆物种特异性立体异构体选择性富集及其潜在机理

得克隆(dechlorane plus, DP)是一种氯代添加型阻燃剂,自2006年首次在环境中被报道检出后,在全球各种环境和生物介质中被检出,已成为广受关注的一类新环境污染物。DP的工业品由2种同分异构体(syn-DP和anti-DP)组成,生物中DP的组成与工业品的组成并不完全一致。笔者总结了DP在生物中富集的文献。现有文献有关DP的生物富集研究主要集中在鱼、鸟及部分哺乳动物。鱼类中普遍观察到syn-DP的相对富集,部分鸟类样品中观察到anti-DP的相对富集。大量文献将生物中DP的组成与工业品DP的组成直接比较来判定是否存在生物对DP的立体异构体选择性富集,忽视了环境与生物过程对DP组成的改变,因此,DP在生物中的立体异构体选择性富集情形可能被低估。室内暴露实验揭示选择性代谢与排泄是造成DP在生物中选择性富集的主要原因,但具体的代谢、排泄的机理目前并不明晰。DP在生物中的立体异构体选择性富集还受生物组织、体内浓度、生物所处的营养级和性别等众多因素的影响。要了解DP生物富集中的立体选择性富集机理,还需要进一步深入研究DP在不同生物中的吸收、代谢及与生物大分子之间的相互作用。     

镍钴转运酶NiCoT基因的克隆表达及基因工程菌对镍离子的富集

利用PCR技术从Staphylococcus aureus/ ATCC6538基因组中扩增出大小为1?053 bp的镍钴转运酶基因NiCoT gene,将其连接到pET-3c载体上构建重组质粒,并转化至E.coli BL21.筛选阳性菌并经酶切分析和PCR扩增双重鉴定.核苷酸序列测定及分析结果与GenBank中报道的同类基因相似性高达97%以上,表明其具有正确的NiCoT基因核苷酸序列.重组菌的SDS-PAGE结果图谱中,在相对分子量为39?000附近有特异性蛋白条带,大小符合预测值,表明NiCoT基因在E.coli BL21中成功表达.基因工程菌在IPTG用量为1.00 mmol·L^-1,诱导时间为4 h的条件下培养对镍离子的富集能力最高.在不同镍离子浓度时,基因工程菌对溶液中Ni²⁺的平衡富集量为11.33 mg·g^-1,与原始宿主菌相比提高了3倍.对基因工程菌吸附镍和钴的实验表明,Staphylococcus aureus ATCC6538的NiCoT对镍具有较高的特异性和富集容量,属于第Ⅲ类镍钴转运酶.     

生物转鼓过滤器反硝化去除NO过程中微生物群落结构多样性解析

采用PCR-DGGE技术分析了生物转鼓过滤器(RDB)反硝化去除NO过程中的微生物多样性.研究结果表明,RDB中存在16种优势菌,并且沿填料径向不同位置的DGGE图谱差异性不大,细菌群落结构具有较高相似性.通过DGGE图形比较和微生物群落生物多样性指数计算,发现在RDB内加入CuⅡ(EDTA)络合剂后,NO去除率上升,而微生物群落多样性先增加后又下降,但群落结构变化不显著.对DGGE图谱中8条主带进行回收、扩增、克隆和测序,结果显示RDB中微生物群落主要由Cytopahga-Flexibacteria-Bacteroides(CFB)group Bacteroides、β-Proteobacterium、γ-Proteobacterium和Clostridium sp.组成.反硝化功能与条带G-5(属于γ-Proteobacterium)和G-6、G-8(属于β-Proteobacterium)所代表的菌种相关,相似性≥98%.G-3序列与GenBank数据库中2个最相似序列的相似性只有93%和92%,表明这个条带所代表的微生物可能为新的未培养微生物.     

夏季太湖梅梁湾水体中细菌的群落结构

利用高通量测序技术,选择16S rRNA V6区作为目标片段,对夏季太湖梅梁湾水体中的细菌群落结构进行了分析,结果表明,共产生了101 427条优质序列,细菌为100 935条,占99.5%;在蓝藻暴发期间,共检测到14门,55属,610个操作分类单位。优势门类为蓝藻门(39.7%),放线菌门(27.2%)和变形菌门(23.4%),微囊藻属(21.0%)和聚球藻属(15.9%)为主要优势种。     

Bacterial diversity and distribution in the southeast edge of the Tengger Desert and their correlation with soil enzyme activities

The nature of microbial communities and their relation to enzyme activities in desert soils is a neglected area of investigation. To address this, the bacterial diversity and distribution and soil physico-chemical factors were investigated in the soil crust, the soil beneath the crust and rhizosphere soil at the southeast edge of the Tengger Desert, using the denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rRNA genes amplified by the polymerase chain reaction. Phylogenetic analysis of the sequenced DGGE bands revealed a great diversity of bacteria. The Proteobacteria, consisting of the α, β, and γ subdivisions, were clearly the dominant group at all depths and in rhizosphere soil. Analysis of the enzyme activities indicated that the rhizosphere soil of Caragana korshinskii exhibited the highest protease and polyphenol oxidase activities, and in the soil crust there were increased activities of catalase, urease, dehydrogenase and sucrase. The bacterial community abundance closely correlated with soil enzyme activities in different soils. The presence of Cyanobacteria correlated with significant increases in protease, catalase and sucrase in the soil crust, and increased urease in the rhizosphere soil of Artemisia ordosica. The occurrence of Acidobacteria was associated with significant increases in urease, dehydrogenase, and sucrase in the rhizosphere soil of C. korshinski. The presence of γ-Proteobacteria correlated with a significant increase in polyphenol oxidase in the rhizosphere soil of A. ordosica. The study indicated a close relationship between the soil bacterial community and soil enzymes, suggesting the necessity of further investigations into bacterial function in this desert ecosystem.     

用于分子生态学研究的堆肥DNA提取方法

分子生态学为堆肥微生物的研究提供了新的技术手段,DNA的提取是该技术的基础,但由于腐殖酸类物质的污染,增加了堆肥微生物总DNA的提取难度.采用了3种不同的方法(溶菌酶法、超声波破碎法和蛋白酶K-CTAB法)从堆肥中提取微生物的总DNA,使用核酸和蛋白质分析仪检测后表明3种提取方法获得的DNA产量均较高;琼脂糖凝胶电泳结果表明其长度约为23 kb;使用细菌16S rRNA基因通用引物(27F和1 495R)对总DNA进行PCR扩增,都获得了几乎全长的16S rDNA序列(约1.5 kb);利用限制性内切酶(Hae Ⅲ和AluⅠ)对纯化后的PCR产物进行RFLP分析,结果表明3种方法提取的DNA反映了比较一致的微生物多样性.虽然3种方法各有优缺点,但其提取的DNA都可以用于堆肥微生物的分子生态学研究,可以根据实际需要选用某一种方法用于提取堆肥总DNA.