厌氧氨氧化菌的富集培养与分子鉴定

采用传统培养方法与分子生物学方法相结合,进行了厌氧氨氧化菌的分离培养与分子鉴定.富集培养以2种不同反应器的厌氧氨氧化污泥作为分离源,以亚硝酸盐与铵盐为底物.经过2 a传代培养获得2个培养系,对亚硝酸盐及铵盐具有稳定的去除能力,氨氮去除率为85%左右.通过16S rRNA克隆文库方法对培养系中浮霉菌门微生物群落结构进行了多样性解析,结果表明2个培养系中的厌氧氨氧化菌是同一种微生物,代表序列比对结果与"Kuenenia stuttgartiensis"同源性为99%.采用"K.stuttgartiensis"的特异探针对培养系进行了荧光原位杂交分析(FISH),进一步证实"K.stuttgartiensis"是培养系中的优势厌氧氨氧化菌,占总菌群数的80%～90%.对反应器中"K.stuttgartiensis"的丰度变化进行了FISH跟踪检测,发现原始接种污泥中"K.stuttgartiensis"为主要厌氧氨氧化菌,经过2 a运行该菌在污泥中的丰度由11%提高到24%.     

功能宏基因组学在新型抗生素耐药基因研究中的应用进展

抗生素耐药性是二十一世纪人类面对的最严峻的环境健康问题之一.抗生素耐药基因(Antibiotics resistance genes, ARGs)被认为是一类新型环境污染物.当前针对ARGs的主要研究方法有细菌分离和培养法、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、和宏基因组法.然而,仅有功能宏基因组方法能发现新型的ARGs.功能宏基因组方法利用新一代测序技术的高通量的特性,结合分子生物学技术和功能筛选构建有关抗生素耐药性的基因库,通过生物信息学分析高效地发现新型ARGs.本文综述了近来利用功能宏基因组技术筛选新型ARGs的相关研究进展,总结了功能宏基因学相关的技术和方法的优势和限制,并展望了功能宏基因学方法进一步发展的方向.     

不同窖龄窖泥古菌的系统发育多样性分析

为探索不同窖龄窖泥古菌类群与演替规律,分别提取20、50和150年窖龄窖泥样品总DNA,应用PCR-A R DR A和16S rDNA克隆测序技术对不同窖龄窖泥古菌群落结构进行研究.结果表明:191个克隆子分成22个可操作分类单元(OTUs),系统发育分析归为6个类群,分别属于甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)、甲烷粒菌属(Methanocorpusculum)、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)和甲烷螺菌属(Methanospirillum).不同窖龄窖泥的优势古菌类群有明显差异,20年窖泥优势古菌类群以乙酸利用型Methanosarcina、Methanosaeta为主,50年、150年龄窖泥优势古菌类群以氢气营养型Methanocorpusculum、Methanobacterium为主;随着窖龄的增加,窖泥古菌Shannon-Wiener多样性指数(H)和Berger-Parker优势度指数(D)呈增加的趋势,Pielou均匀度指数(J)呈降低趋势;不同窖龄窖池古菌的相似性系数为0.429~0.677,50年和150年窖泥的菌群结构最为相似.本研究揭示了不同窖龄窖泥古菌系统发育多样性的差异与窖泥老熟的关系.     

松嫩草地羊草克隆构型特征在不同种群密度下的可塑性

对不同密度羊草(Leymuschinensis)种群的克隆构型特征进行了调查,比较在资源水平相对一致时,羊草克隆构型特征,如根茎节间长度、间隔子长度、分枝距离和分枝角度,对种群密度变化的可塑性.结果表明:随着种群密度增加,羊草根茎节间长度和间隔子长度逐渐减小,分枝角度增大,且分枝角度在不同密度间差异显著.分枝角度的频率分布格局在不同密度间也存在显著差异,种群密度高时,羊草根茎具有更多的大分枝角.此外,羊草根茎节间长度、间隔子长度和分枝角度与其种群密度具有较强的冥函数关系.羊草根茎克隆特征在不同密度间具有较强的可塑性,当种群密度低时,羊草克隆特征更趋于“游击型”;随着种群密度的增加,其“游击型”特征减弱. 图2表2参19     

gsh1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.图7表1参10     

北戴河近岸沉积物中微生物16S rDNA的PCR-RFLP分析

采用间接法提取了北戴河地区近岸沉积物中微生物的总DNA,以细菌的通用引物27F和1492R扩增16S rDNA片段,将扩增产物克隆到T-载体上,并转化大肠杆菌感受态细胞,构建沉积物中细菌16S rDNA克隆文库.PCR扩增基因文库中插入的16S rDNA外源片段,用两种限制性内切酶Hha Ⅰ和Rsa Ⅰ分别酶切,获得该海洋沉积物131个克隆的酶切指纹图谱.结果表明:HhaⅠ和Rsa Ⅰ联合酶切产生了41个基因分型,文库的覆盖度达74.81%,Hha Ⅰ和Rsa Ⅰ单酶切产生的基因分型分别为30和22,但文库的覆盖度高:克隆文库中存在一种优势类群,占总克隆的23%.16S rDNA测序结果表明:北戴河近岸沉积物中的细菌在分类方面主要属于α-和γ-变形杆菌亚门.     

甲烷厌氧氧化协同硝酸盐还原菌群驯化及其群落特征

伴随硝酸盐还原的甲烷厌氧氧化是协同减少环境中硝酸盐及甲烷的有效途径.利用实验室废水处理厌氧污泥、污水处理厂厌氧污泥和填埋场覆土驯化富集硝酸盐还原型甲烷厌氧氧化菌群.考察菌群的甲烷氧化效果,结果发现接种污水处理厂厌氧污泥体系甲烷转化量最大,为0.05 mg·d-1.微生物群落结构分析显示,该体系中甲烷微菌和甲烷八叠球菌是甲烷氧化菌,假单胞菌、梭状芽胞杆菌和热单胞菌参与了硝酸盐的还原反应.硝酸盐的量影响甲烷的转化率及菌群结构.当硝酸盐浓度为200 mg·L-1时,体系中的硝酸盐还原菌为假单胞菌和梭状芽胞杆菌;浓度增加至500 mg·L-1时,硝酸盐还原菌则是假单胞菌和热单胞菌.同时,甲烷转化率增加34.7%.研究结果为该菌群应用于含甲烷废气与含硝酸盐废水的协同处理提供科学依据.     

萘降解质粒pND6-1中萘趋化基因nahY的克隆和核苷酸序列分析

假单胞菌（Pseudomonas）ND6菌株的萘降解基因位于102kb的质粒pND6-1上。以pUC18质粒为载体，制备了含有1.5-3.0kbpND6-1DNA随机片段的基因文库。通过DNA测序和DNA序列的同源性分析，从基因文库中筛选出含有萘趋化基因nahY的克隆。NahY基因的大小为1617bp，编码的萘趋化蛋白由538个氨基酸组成，与假单胞菌G7菌株的nahY基因相比，核苷酸序列的同源性是96.7％，编码的氨基酸序列的同源性是95％。图4参7