β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达

从Bacillus subtilis JNA 3-10中克隆出β-甘露聚糖酶基因成熟肽链编码序列manA1和含信号肽的β-甘露聚糖酶基因manA2,在B.subtilis 168中克隆表达,分别筛选获得高效分泌表达β-甘露聚糖酶的重组菌株BPM1001(pMA5-manA1/B.subtilis 168)和BPM1002(pMA5-manA2/B.subtilis 168),结果表明菌株BPM1002总酶活力是菌株BPM1001的9.65倍,是原始菌株的13.1倍.在基因manA2下游引入His序列克隆出β-甘露聚糖酶基因manA3,获得枯草芽孢杆菌168重组菌株BPM1003.采用Ni-NTA柱纯化重组菌株BPM1003分泌表达的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质,该酶促反应的最适pH为6.5,最适温度为65℃,在37℃条件下保存一个月酶活力依然保留有77.8%.5 L发酵罐放大实验结果表明魔芋粉对于产β-甘露聚糖酶具有明显的诱导作用,酶活力最高可达2 748.82 U/mL.图9表3参19     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析

提取东太平洋深海沉积物宏基因组DNA,构建了未培养微生物宏基因组文库.该文库平均插入片段30 kb以上,含有7 000个克隆,含外源DNA总长度约为210 Mb.从文库中筛选到18个产胞外蛋白酶的克隆,16S rRNA分析表明,它们分别来源于假单胞菌(Pseudomonas)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)和弧菌(Vibrio)3个菌属.根据活性大小及来源菌株的16S rRNA序列比较,选择10个蛋白酶进行酶学性质分析,结果表明,它们的最适作用pH值在7～10之间,最适作用温度在10～40℃之间.其中Pro20蛋白酶最适作用温度最低,为10℃;Pro1蛋白酶具有最适作用温度低(20℃)、pH耐受性好、热稳定性较好等特性,具有良好的应用开发潜力.图6参16     

16S rDNA克隆文库方法分析好氧颗粒污泥细菌组成

采用构建16S rDNA克隆文库方法对好氧颗粒污泥的细菌种群多样性进行研究. 随机测定了82个克隆子序列(700 bp),Blast比对结果表明,好氧颗粒污泥中微生物群落具有高度多样性,可分为7个主要类群,其中,β变形菌(β-Proteobacteria)类群和鞘脂杆菌(Sphingobacteria)类群在文库中所占比例最大,分别为34.16%和30.50%;其次是Candidate division TM7类群、黄杆菌(Flavobacteria)类群和γ变形菌(γ-Proteobacteria)类群,分别为9.76%,7.32%和7.32%;放线菌(Actinobacteria)类群和α变形菌(α-Proteobacteria)类群所占比例相对较小,分别为4.88%和1.22%. 序列分析结果表明,好氧颗粒污泥中不仅含有对好氧颗粒污泥形成和稳定运行具有重要作用的食酸菌属(Acidovorax)细菌、假单胞菌(Pseudomonas)等细菌,还含有对CODCr和氨氮具有很好去除能力的Micropruina glycogenica,丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)等细菌.      

西藏米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建

青藏高原土壤中富含特殊的微生物资源,因大多数未能得到培养而无法利用.提取微生物总DNA及构建宏基因组文库的方法是研究未培养微生物的重要方法(免培养法).两藏米拉山高寒草甸土壤中腐植酸、有机质含量非常高,DNA提取非常困难,本研究表明卣接法提取该样品的DNA片段小,杂质含量高,不能满足构建大插入片段文库的要求;结合低速离心和Nycodenz密度梯度离心先分离出微生物细胞的间接法虽然DNA产率降低,但是纯度高,片段长,多样性丰富,更适合于构建大插入片段文库.在间接法提取高质量西藏高寒草甸土壤微生物DNA的基础上,成功构建了一个包含30 624个克隆、库容量超过1 Gb、稳定性好的宏基因组Fosmid文库,为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基因研究奠定了基础.图7表3参27     

微氧折流反应器启动过程产甲烷菌群落结构变化特征

采用实时荧光定量PCR和构建克隆文库的方法,对微氧折流反应器启动过程中产甲烷菌群落结构进行分析,以期了解反应器去除污染物机理.结果表明:随着反应器的运行,产甲烷菌丰度整体呈现增加趋势,化学需氧量(COD)去除率由启动初期的30%左右逐渐上升到75%左右,出水pH也从初期的弱酸性到后期稳定在7.3左右.其中,微氧曝气的1#格室产甲烷菌基因丰度先由第一阶段的1 580 copies ng-1(S1A)下降到第二阶段的1 355 copies ng-1(S2A),最后稳定阶段又升高到2 864 copies ng-1(S3A).2#格室的产甲烷菌基因丰度表现出与1#格室类似的趋势,但是相比1#格室变化幅度小,3个阶段的产甲烷基因丰度依次分别为2 024 copies ng-1(S1B)、1 970 copies ng-1(S2B)、2 282 copies ng-1(S3B).处于厌氧状态的3#格室的产甲烷菌基因丰度随着反应器的运行逐步上升,稳定后达到最大,为3 508 copies ng-1(S3C).1#格室中,产甲烷优势菌由第一阶段的Methanobacteriales目(占所得产甲烷菌序列群50%)变为第三阶段的Methanomicrobiales目(80%).2#格室中没有明显的优势产甲烷菌,群落结构相对稳定,隶属于Methanomicrobiales目的产甲烷菌序列比例在3个阶段分别为36.4%、36.4%和30%.3#格室稳定运行后有60%的产甲烷菌序列群属于Methanosarcinales目,成为优势菌.在反应器运行的不同阶段,2#格室的生物多样性均高于1#格室,3#格室的多样性在前两个阶段没有变化,而在第三阶段升高.因此,在启动过程中,微氧折流反应器不同格室产甲烷菌的基因丰度、群落结构和生物多样性表现出不同的变化特征.     

黄颡鱼黑色素细胞原代培养及迁移相关基因克隆分析

黑素皮质素受体-1(MC1R)在鱼体中对黑色素细胞的分化及迁移起主要的调控作用,而且在神经系统和免疫系统中均表现出重要的生理功能。本研究对黄颡鱼表皮黑色素细胞的培养条件进行探索,并在此基础上对MC1R基因进行克隆,为后续研究黄颡鱼黑色素异常的细胞及分子机理研究提供基础。结果表明,黄颡鱼表皮黑色素细胞在27℃培养条件下,72 h开始贴壁生长,培养基中添加20%小牛血清培养效果比添加10%小牛血清好。此外,我们对黄颡鱼MC1R基因进行克隆。MC1R基因克隆方面,黄颡鱼MC1R基因全长为936 bp,编码312个氨基酸,与剑尾鱼(Xiphophorus maculates)、孔雀鱼(Poecilia reticulata)、条斑星鲽(Verasper moseri)、海鲈(Dicentrarchus labrax)、大菱鲆(Psetta maxima)等5种鱼类MC1R基因的同源性分别为97%、96%、90%、90%、90%,系统分析结果显示,黄颡鱼MC1R基因在进化树上的位置与黄颡鱼的分类所处位置基本吻合。黄颡鱼表皮黑色素细胞原代培养的条件为:27℃,添加20%小牛血清,所克隆基因为黄颡鱼MC1R基因。本研究为后续研究黄颡鱼黑色素异常的细胞及分子机理研究提供基础。     

厦门冬季PM_（2.5）颗粒物中细菌和真核微型生物群落组成及其来源分析

近年来由于雾霾事件频发,有关细颗粒物PM2.5的来源、组成及迁移转化规律已经引起了人们的广泛关注,然而对于PM2.5颗粒物中微生物的组成和来源还知之甚少。本文应用T–RFLP、克隆文库和测序方法研究厦门2012年冬季PM2.5颗粒物中细菌和真核微型生物的群落组成,并分析其潜在的来源环境。研究结果表明：与克隆文库方法相比,T–RFLP分析所得的物种数量（TRF峰）相对较多,说明T–RFLP是快速、灵敏分析空气微生物群落特征的高效手段之一。T–RFLP和克隆文库结果表明,PM2.5颗粒物中细菌和真核微型生物群落多样性较高,其中2%的细菌16S rRNA基因和42%的真核微型生物18S rRNA基因序列与已知序列的相似度低于97%。分类分析表明,Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes和Proteobacteria是PM2.5颗粒物细菌的主要类群,其相对丰度分别为2.91%、10.68%、41.75%和44.66%;Stramenopiles、Alveolata、Metazoa、Fungi和Viridiplantae是PM2.5颗粒物真核微型生物的主要类群,其相对丰度分别为5%、7%、15%、20%和39%。然而,尚有14%的真核微型生物18S rRNA基因序列未能分类到已知门类,说明气溶胶真核微型生物方面的研究尚存在较大空白。与文献对比分析表明,厦门城区空气微生物的动态性较强,环境来源多变。环境来源分析表明,厦门虽然属于典型海滨城市,但其空气微生物的重要环境源可能为淡水,其次是土壤、水体沉积物、污水系统和动物粪便等。而季节性气团输送可能是厦门冬季气溶胶微生物多来源于淡水的原因之一。     

克隆整合提高了入侵植物空心莲子草对北美车前的竞争力

选取北美车前Plantago virginica L.为竞争背景草,以空心莲子草Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb.为研究对象,通过切断或保持其先端分株与后端分株间的匍匐茎连接,研究了克隆整合对先端分株生长以及竞争力的影响。结果显示：不管是否存在竞争,克隆整合显著提高了空心莲子草先端分株的生物量、总匍匐茎长度、叶片数目和分株数目,并降低了其对茎的生物量投资。此外,克隆整合显著提高了空心莲子草先端分株对北美车前的竞争力。种间竞争显著降低了空心莲子草的生长,但并没有显著影响其生物量分配。上述结果表明,克隆整合在一定程度上能够促进入侵克隆植物的生长和竞争力,从而可能潜在影响其入侵性。     

石油污染土壤非培养放线菌多样性分析

采取大港油田石油污染土壤,分析其石油污染状况。利用放线菌传统培养分离技术、荧光PCR检测技术以及放线菌16S rDNA克隆文库分析技术,探讨了石油污染土壤放线菌群落丰度及其结构特征。研究结果表明:石油污染导致了土壤放线菌群落丰度降低,而荧光PCR检测较传统的培养分离技术,更能准确、真实地反映土壤放线菌群落丰度。同时,放线菌16S rDNA克隆文库结果显示油污土壤非培养放线菌主要包括链霉菌属(Streptomyces)、分支杆菌属(Mycobacterium)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、微杆菌属(Microbacterium)、放线菌属(Actinomyces)、酸微菌属(Acidimicrobium)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)和乔治菌属(Georgenia)等8个类属,其主要种属与目前报道的具有石油烃降解功能的放线菌类群较为一致。该研究为从非培养放线菌角度修复石油污染土壤提供了重要的理论基础。     

基于分子技术的1株产毒藻藻际细菌多样性分析

采用构建16S rDNA克隆文库的方法,对实验室保存的1株产毒塔玛亚历山大藻在不同时期的藻际细菌群落多样性进行了分析.限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)结果表明,塔玛亚历山大藻藻际微生物的16S rDNA克隆文库中的克隆子总共可分为 34 种基因型,选取各谱型的代表克隆子测定其16S rDNA片段核苷酸序列,将所获得的序列与GenBank数据库进行BLAST比对,结果表明所有基因型分属于2个细菌类群：变形细菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes).在延滞期的藻培养液中,α-Proteobacteria占36.4%,β-Proteobacteria占9.1%,γ-Proteobacteria占27.3%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占27.3%;在指数后期的培养液中,α-Proteobacteria占53.3%,β-Proteobacteria占13.3%,γ-Proteobacteria占6.7%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占26.7%; 在稳定期的培养液中,α-Proteobacteria占47.8%,β-Proteobacteria占8.7%,γ-Proteobacteria占21.7%,δ-Proteobacteria占4.3%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占17.4%;其中有不少克隆子与已知序列同源性低于 94%,表明塔玛亚历山大藻藻际环境中附着有新的未开发的微生物资源,这些细菌可能在微藻的生消过程中起着重要的调控作用,所以本研究结果在赤潮微生物调控中具有重要的理论意义和应用价值.