环境样品中亚硝酸细菌amoA基因的克隆与测序

对从环境样品中分离的亚硝酸细菌(Ammonia oxidizingbacteria)amoA基因进行克隆与测序,为构建基因工程菌打下基础。采用亚硝酸细菌选择性培养基,从4个不同的畜牧养殖污水处理厂采集的样品(分别编号为1,2,3,4)在室温下富集培养2个月后,采取酚氯仿抽提的方法提取DNA。根据已报道的亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)amoA基因序列,设计引物AMOB AMOE,并在AMOB,AMOE的5′-端分别加上了BamHⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点,以利于进一步酶切和克隆。用AMOB AMOE对4种样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,4种样品中1号和3号样品扩增得到预期长度的DNA片段,2号和4号样品扩增没有得到预期片段。回收纯化PCR产物与pGEM-T载体连接,构建amoA基因测序载体,并转化E.coliM15。测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果显示,扩增得到的DNA片段均与Nitrosomonassp.GH22的amoA基因有99 7%的同源性,可从环境中分离的亚硝酸细菌中克隆出amoA基因。      

硫铁填料和微电流强化再生水脱氮除磷的研究

为提高再生水质量,在不同C/N和HRT条件下,对比分析硫铁复合填料和微电流作用强化再生水深度脱氮除磷效果.结果表明,硫铁复合填料和微电流作用均能够强化氮、磷的深度去除效果,且二者结合能够使反硝化系统pH值稳定在7.2~8.5之间.系统中TN主要靠异养反硝化、氢自养反硝化和硫自养反硝化作用去除,94.04%的TP是以生成磷酸铁沉淀的形式去除.分别从填料上取生物膜,进行Miseq高通量测序,构建细菌16S rRNA基因克隆文库.结果发现,在仅有海绵铁作用系统中,同时具有异养反硝化和氢自养反硝化功能的细菌所占比例达到29.47%;硫铁复合填料和硫铁微电流作用系统中,具有硫自养反硝化功能的Thiobacillus(硫杆菌属)所占比例分别达到60.47%和40.62%.因此,硫铁复合填料和微电流作用用于强化再生水深度脱氮除磷具有明显的优势.     

三唑磷作用下翡翠贻贝抑制性消减杂交文库构建与分析

采用抑制性差减杂交技术,构建了三唑磷农药急性胁迫下翡翠贻贝雌贝性腺正反向消减杂交cDNA文库.正反向文库共有117个表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）与NCBI数据库中已知功能蛋白具较高同源性,假定蛋白12种,另有195个ESTs未检索到同源序列.正向文库中含有细胞周期蛋白、性激素合成蛋白、DNA修复蛋白、能量代谢相关蛋白等一系列与生殖、应激适应和代谢相关的转录本信息,而反向文库中的差异ESTs主要涉及DNA复制、转录和翻译调控基因以及骨架蛋白.结果表明三唑磷对翡翠贻贝的毒性涉及到生殖调控、能量代谢、应激适应、转录翻译调控等生理代谢的多个方面,正向文库中发现的几种生殖调控基因（细胞周期蛋白、周期蛋白依赖性蛋白激酶、合子DNA复制许可因子、精子特异性蛋白、雌激素硫酸转移酶和卵黄膜卵透明带域蛋白）可能是三唑磷生殖干扰毒性作用过程中的关键基因,这为有机磷农药的生殖毒性探索提供了基础数据.     

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.     

3DBER-S反硝化脱氮性能及其菌群特征

针对污水处理厂尾水TN去除问题,采用16S rDNA克隆文库法,探究了3DBER-S(三维电极生物膜耦合硫自养脱氮工艺)的强化脱氮机制及其菌群特征. 结果表明,I(电流)和HRT(水力停留时间)对3DEBR-S中氢自养和硫自养反硝化作用所占比例的影响较大,但对脱氮效率影响不显著. 当进水C/N〔ρ(COD_Cr)/ρ(TN)〕为1、ρ(NO₃--N)为35 mg/L、I为300 mA、HRT为4 h时,NO₃--N和TN去除率可分别稳定在80%和74%以上. 16S rDNA克隆文库结果显示,反应器中β变形菌纲为优势菌群,占47.89%〔以OUT(操作单元)计〕. 在β变形菌纲中,与具有反硝化功能的陶厄氏菌属(Thauera)相似的细菌所占比例最大,为52.94%;与可分别利用硫和氢为电子供体进行反硝化脱氮的硫杆菌属(Thiobacillus)和食酸菌属(Acidovorax)相似的细菌分别占17.65%和14.71%. 3DBER-S中存在异养联合氢自养和硫自养反硝化协同去除硝酸盐氮的作用,可为反硝化脱氮提供充足的电子供体,节约了有机碳源消耗,并保证了稳定高效的脱氮效果.      

基于宏基因组学壳聚糖酶挖掘研究

壳聚糖酶(EC3.2.1.132)可有效地将壳聚糖降解为活性良好和应用前景广泛的低分子壳聚糖或壳寡糖,但目前存在专一性强的壳聚糖酶发酵水平低、种类单一、应用性能较差等问题.本研究从虾蟹堆积场淤泥采样,采用宏基因组文库方法,从其Fosmid文库中筛选出壳聚糖酶基因ChiE.测序表明,ChiE由1 362 bp组成,编码453个氨基酸,预测分子量(Mr)为42×103左右.将ChiE与pET-28a(+)载体连接,转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami(DE3)构建了壳聚糖酶重组菌.采用离子交换柱(DEAE Sepharose FF)和凝胶色谱柱(SuperdexTM 75)纯化目的蛋白.酶学性质结果显示,该酶最适作用温度70℃,最适pH 6.0,Li+、Sr2+、K+等离子对其具有一定激活作用,Fe3+、Pb2+、Fe2+等离子则具有不同程度的抑制.在最适作用条件下,该酶比酶活为2 158 U/mg.本研究表明,重组菌E.coli Rosetta-gami(DE3)/ChiE具有培养简便、酶发酵产量大等优点,结果可为利用基因工程菌生产壳聚糖酶奠定基础.图5表2参17     

软骨藻酸间接竞争ELISA检测方法的研究

为研究满足海产品日常分析的免疫检测法,采用自行制备的软骨藻酸多抗隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,分别摸索了抗原、一抗、二抗的最佳使用浓度及温育温度与时间,并用该方法测定了贝类样品中的DA含量.结果表明,该方法最低检测限约为18 ng·mL-1,贝类样品测定的加标回收率在47.2%—94.2%之间.RSD在12....     

不同生境来源硝化细菌群对氨氮的去除性能

硝化细菌是微生物脱氮的关键功能菌群之一,筛选优质硝化细菌对于强化微生物脱氮具有重要意义.将河流沉积物、土壤自然环境和市场售人为环境3种生境来源的硝化细菌功能进行比较研究,并利用分子生物学手段分析了硝化细菌群落结构.结果表明,沉积物生境中硝化细菌的活性以及耐氨氮、pH和盐度等环境因子的能力高于土壤和市售硝化细菌.利用MP...     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及表达

从曲霉属10株试验菌中筛选得到一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉FTA-008.该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活性达2.89 U/mL,适宜产酶周期为3 d.通过设计特异引物,以该菌株的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为2 511 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中AJ132386的β-葡萄糖苷酶序列相比,氨基酸序列同源性达96.8%.经毕赤酵母表达,β-葡萄糖苷酶比活力达7.85 U/mg.图3表1参13     

降解2,4-二氯酚的厌氧颗粒污泥-悬浮载体生物膜反应器中古细菌的种群结构

采用古细菌特异性引物ARC21F/ARC958R对污泥样品的总DNA进行聚合酶链式反应(PCR)、克隆、序列分析等,研究了降解2,4-二氯酚(2,4-dichlorophenol, 2,4-DCP)的厌氧颗粒污泥-悬浮载体生物膜反应器(Anaerobic granular sludge-suspended carrier biofilm reactor, ASBR)中古细菌的种群分布.结果表明,接种污泥和ASBR各层污泥中存在共有的古细菌: Methanothrix soehngenii和Uncultured archaeon等, M. soehngenii、uncultured archaeon TA05和uncultured archaeon TA04在接种污泥和ASBR各层污泥中的分布为:接种污泥的丰度＜上层的丰度＜中层的丰度＜下层的丰度. uncultured archaeon 44A-1、uncultured archaeon 39-2、uncultured archaeon 46-1和uncultured archaeon 69-1的分布为:接种污泥的丰度＞上层的丰度＞中层的丰度＞下层的丰度.经2,4-DCP驯化后, ASBR上层悬浮填料区出现特有的古细菌unidentified crenarchaeote等,下层厌氧颗粒污泥区特有的古细菌为uncultured archaeon ZAR106等.接种污泥特有的6种古细菌Methanosaeta concilii等经2,4-DCP驯化后消亡,污泥中古细菌多样性减少,以下层颗粒污泥中古细菌种群丰度的变化最为明显.图2表2参21