猪粪便污染特异性分子标记筛选及其PCR检测方法的建立

肠道微生物群落在与其宿主长期协同进化过程中会形成大量的宿主-肠道微生物互作基因,这些互作基因具有一定的宿主肠道微生物特异性,利用其设计分子标记能有效识别粪便污染源.本研究首次利用竞争性杂交的方法富集猪粪便特异性基因,从中筛选出具有猪粪便特异性的基因片段,以此设计引物并建立相应的PCR检测方法,并对采集样进行应用调查.竞争性杂交富集的猪粪便特异性基因文库以拟杆菌群(Bacteroidetes)(43.2%)和梭状杆菌群(Clostridia)(19.5%)相似序列为主,其蛋白功能主要分为3大类:与信息贮存与加工有关(7.6%),与细胞加工及信息传导有关(12.8%)以及与代谢有关(22.0%).进一步针对功能蛋白序列筛选宿主粪便特异性分子标记.分析表明序列3-53-2对应引物可作为猪粪便污染的特异性分子标记,针对其建立的常规PCR方法对粪便DNA的检出限可低至0.01 ng·μL-1,且对实际样品具有较高的应用灵敏性(97%)和特异性.进一步对可能受污染水样进行猪粪便污染特异性检测,结果显示不同地区的阳性检出率高达75%~100%,证明了此方法的有效性,可为研究微生物示踪技术在非点源污染方面的应用提供一定的基础数据.     

不同TOC/NH4+-N对厌氧氨氧化脱氮效能的影响

采用SBR厌氧氨氧化反应器,研究了不同TOC与NH_4~+-N比值对厌氧氨氧化反应器的脱氮效能的长短期影响.结果表明,在有机物短期影响时,反应器所能承受的最大TOC/NH_4~+-N为1.4,总氮去除速率可达0.26 kg·(m~3·d)~(-1).长期影响下,在TOC/NH_4~+-N小于0.4时,反应器可获得最高脱氮效能,总氮去除率为0.34 kg·(m~3·d)~(-1),TOC/NH_4~+-N大于0.4后,反应器脱氮效能持续降低,并且短期内厌氧氨氧化菌难以迅速恢复活性.利用q PCR(定量PCR)技术对长期影响前后反应器内菌种群落变化做定量分析,结果表明随着有机物的增加,反应器中的ANAMMOX菌数量从2.9×10~(11)copies·mL~(-1)减少至3.15×10~(10)copies·mL~(-1),在TOC/NH_4~+-N大于1.6的环境中,NH_4~+-N未能由厌氧氨氧化菌去除,厌氧氨氧化菌不能表现出生物活性.此时测得反硝化菌数量为3.0×10~9copies·mL~(-1),反应器中的NO_2~--N绝大部分由反硝化去除,虽然反硝化菌数量远少于ANAMMOX菌,但能表现出远超ANAMMOX菌的活性.     

不同氮水平下间作对玉米土壤硝化势和氨氧化微生物数量的影响

利用荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR)技术,结合氨氧化细菌(ammonia oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia oxidizing archaea,AOA)丰度和土壤理化性质的测定,探索了不同氮水平下间作对玉米土壤硝化势(PNF)的影响.试验设置玉米单作和与马铃薯间作两个种植模式,4个施氮水平(不施氮N0、1/2常规施氮N1、常规施氮N2和3/2常规施氮N3)的随机区组试验.结果表明,从不施氮到常规施氮,土壤硝化势和AOA、AOB数量均随施氮量增加而逐渐增加,而高氮(N3)时与N2没有显著差异;间作对土壤硝化势、AOA与AOB数量的影响与施氮量和作物生育期有关,低氮投入(N1)间作有利于增加土壤氨氧化微生物数量和硝化作用.施肥是硝化势增加的主要驱动因子,相关性分析结果表明,土壤含水量是影响PNF的主要环境因子;PNF与土壤中AOA、AOB amoA基因丰度成显著的正相关.尽管玉米马铃薯间作降低了土壤中AOA、AOB amoA基因丰度,却使得间作土壤中AOB占据氨氧化微生物数量上的优势.以上结果表明,施氮和间作均影响了土壤硝化作用和氨氧化微生物AOA和AOB数量的变化,这些变化会影响土壤环境质量.     

盐胁迫下Dslhcb3和cao基因的表达及类囊体磷酸化状态转化

LHCⅡ在在类囊体膜中除了进行光能的吸收和传递之外,在维持类囊体膜的结构,调节激发光能在两个光系统之间的分配,光保护以及对各种环境的适应等过程中都起着重要的作用.为揭示盐藻LHCB在盐胁迫下的作用机制,以盐生杜氏藻(Dunaliella salina为材料,应用实时PCR的方法和蛋白电泳技术,研究lhcb3和叶绿素a加氧酶cao基因在低盐胁迫下的表达变化,以及盐藻类囊体膜的磷酸化水平和磷酯酶的变化.结果表明,在低盐环境下,lhcb3和cao基因的表达活性都呈降低的总趋势,这可能是盐藻适应不浓度盐环境胁迫的不反应.类囊体膜蛋白磷酸化水平先是降低,之后有所升高.时,发现磷酸酯酶有着相的变化趋势,并在12 h时最高.由此认为低盐条件下,类囊体膜蛋白在前期磷酸化水平的降低与磷酸酯酶活性降低有关,但在12 h后磷酸化水平有所升高,可能是细胞内平衡调节的结果,即磷酸激酶活性增强的结果.     

应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究

亚历山大藻属的部分藻种(Alexandrium spp.)能够产生麻痹性贝毒毒素(PST),是重要的有害藻华(HAB)原因种.由于亚历山大藻属中的有毒和无毒藻种形态相似,且海水中亚历山大藻的细胞密度通常很低,因此,高灵敏度、高特异性的分子生物学方法在亚历山大藻检测方面具有重要的应用前景.塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是中国近海主要的有毒亚历山大藻藻种,大多属于塔玛亚历山大藻复合种第四类核糖体型(GroupⅣ,以往称为“亚洲温带核糖体型”).因此,本研究尝试将实时荧光定量PCR(qPCR)方法用于我国近海塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ)的快速检测,并对方法的特异性和灵敏度进行了检验.研究表明,所建立的qPCR方法能够特异性地检测我国近海不同海域分离的塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ),方法具有良好的线性响应关系和较高的灵敏度,最低可检出5个藻细胞,具有良好的应用前景.然而,实验也发现,自我国近海分离的塔玛亚历山大藻复合种的不同藻株之间,以及处于不同生长阶段的藻细胞之间,qPCR检测结果存在显著差异,反映了目标藻核糖体RNA基因拷贝数的差异和变化对qPCR检测结果的影响.因此,建议在将qPCR方法用于不同海域亚历山大藻样品检测时,应采用该海域分离的藻株专门构建标准工作曲线,以减小定量分析误差.     

废水处理系统中抗生素抗性基因分布特征

废水处理厂被认为是抗生素抗性基因(ARGs)的重要污染源.为探究抗性基因在进水状况复杂的废水处理厂沿程的分布变化特征,选取以生产抗生素为主导行业的某化工园区废水处理厂,使用实时荧光定量PCR对废水处理厂沿程ARGs的种类、丰度变化进行研究.结果表明,废水处理厂水体中检出16种ARGs,四环素类、磺胺类ARGs为废水处理厂中占主导的抗性基因,并检出可移动遗传元件int I1,其丰度与磺胺类抗性基因的丰度(P 0. 05,r 0. 95)存在相关性,表明可移动遗传元件int I1可能促进了磺胺类抗性基因的迁移和转化.园区医药企业以合成大环内酯类抗生素为主,由于选择性压力,园区废水中,erm B抗性基因的绝对丰度远远高于其他废水中erm B的绝对丰度.废水经过废水处理厂生物处理工艺,总ARGs绝对丰度下降了1. 16个数量级,经过芬顿工艺处理后,总ARGs绝对丰度下降了2. 46个数量级,表明该废水处理工艺中深度处理工艺对ARGs的去除效果优于生物处理.高浓度、可移动的ARGs已经存在于水体中,如果没有得到有效治理,从废水处理厂排出,将给环境带来高度风险.     

A2/O生活污水处理系统中抗生素抗性基因的分布及去除

生活污水处理系统是抗生素抗性基因(ARGs)重要的"汇"和"源"。为探究ARGs在生活污水处理系统包括污水、污泥处理单元全流程的分布变化和去除效率,选取了河北省某A2/O生活污水处理系统,使用普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术对污水、污泥处理工艺沿程各单元的胞内、胞外ARGs的丰度变化及去除效果进行研究。在污水处理系统中对tet C、sul II、erm B、bla PSE-1 4种ARGs、Ⅰ型整合子Int I1以及16S r DNA进行了检测。在总进水中,总胞内ARGs和胞外ARGs绝对丰度分别为1. 30×108copies/m L和2. 09×102copies/m L,总胞内ARGs和胞外ARGs相对丰度分别为3. 16×10-2和5. 29×10-1。最终出水的总胞内ARGs和胞外ARGs绝对丰度去除log值分别达到2. 10log和-3. 20log,总胞内ARGs和胞外ARGs相对丰度去除log值分别达到-0. 21log和0. 60log。泥区废液总回流液的回流会增大总进水胞外ARGs负荷。相关性研究表明,Ⅰ型整合子Int I1可能会促进tet C、erm B、bla PSE-1的传播,水质因子可能会影响ARGs的分布与扩散。     

南京地区污水厂、自来水厂及长江中抗性基因MCR-1和NDM-1的污染特征

近年来,新型抗性基因以其易传播和耐药广等特性,展现出比传统抗性基因更严峻的健康风险,在临床卫生领域受到广泛关注,但目前对其在环境中的行为和风险研究很少.为此,考察了2种有代表性的新型抗性基因MCR-1和NDM-1的污染特征,并借助荧光定量PCR探索了长江下游（南京段）及附近污水厂和自来水厂中MCR-1和NDM-1的分布特征,进而采用RDA（冗余性分析）评价了分布特征受水质指标的影响效果.结果表明:①污水厂进水中MCR-1和NDM-1绝对丰度较高,且随处理流程呈下降趋势,总去除率分别为92.5%和92.7%,但出水中MCR-1和NDM-1绝对丰度仍分别达2.5×108和7.0×106 copies/L.②长江下游（南京段）各采样点MCR-1和NDM-1绝对丰度的范围分别为8.5×107~3.5×109和4.3×105~2.1×107 copies/L,随水流方向呈降低趋势,但在个别采样点出现异常升高的情况,主要受该区域人为污染的影响.③自来水厂处理工艺对MCR-1和NDM-1去除率分别为75.0%和70.6%,但出水中存留的MCR-1和NDM-1绝对丰度分别达1.4×107和6.3×104 copies/L,且MCR-1和NDM-1在排泥水中大量富集.④MCR-1绝对丰度与ρ（COD_Cr）、ρ（NH₃-N）、电导率呈正相关,而NDM-1绝对丰度仅和浊度存在弱相关关系,与其他水质指标无明显相关性.研究显示,污水处理工艺无法有效去除MCR-1和NDM-1,大量抗性基因通过污水厂出水排入长江,同时自来水厂以含有较高绝对丰度抗性基因的长江水作为水源水,最终自来水厂出水中残存的抗性基因可能进入人体,生态健康风险较大.      

武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究

为研究武汉城市湖泊抗生素及抗生素抗性基因的污染水平与分布特征,文章采用超高效液相色谱-质谱法和荧光定量PCR法对南湖、沙湖和东湖水体及底泥中12种抗生素、9种ARGs及Ⅰ类整合子intI1进行定性和定量分析。结果表明,湖泊水体及底泥中均以喹诺酮类抗生素污染为主,浓度范围分别为51.43～105.62 ng/L和9.01～12.93 ng/g。10种目标基因中,tetG、tetM、sul1、sul2、qnrD及intI1的检出率均为100%。磺胺类抗性基因sul1的相对丰度最高(2.39×10~(-2)～3.99×10~(-1)),属于优势抗性基因。intI1含量与4种抗性基因含量(tetG、tetM、sul1及qnrD)、ARGs总量之间均存在显著正相关关系(P0.05),说明intI1是ARGs在城市湖泊环境中进行水平基因转移的重要媒介。冗余分析表明四环素类、喹诺酮类抗生素污染和intI1含量是影响湖泊水体、底泥中ARGs丰度及分布的重要因素。     

制药废水厂抗性基因和微生物群落相关性研究

以2座制药废水厂的生物曝气阶段为例,结合Miseq测序分析技术和荧光定量PCR技术研究活性污泥中微生物群落和β-内酰胺类抗性基因的分布特征、扩增情况及其相关性.结果表明：β-内酰胺类抗性基因OXA-1、OXA-2和OXA-10在2个水厂（J厂和K厂）中均能被检出,OXA型基因丰度在K厂中为5.82×10⁵~3.94×10⁷copies/g（干重）,在J厂的丰度范围为4.84×10⁷~1.09×10¹⁰copies/g,3种基因丰度在曝气处理中显著扩增.Miseq测序结果表明：K厂中主要优势菌门为Proteobacteria,Planctomycetes,Bacteroidetes,Chloroflexi和Acidobacteria等,总平均相对丰度比例为82.13%;J厂中主要优势菌门Proteobacteria,Bacteroidetes,Verrucomicrobia,Gemmatimonadetes和Thermi,总平均相对丰度比例为85.76%.冗余分析显示：生物群落中Bdellovibrio、KD8-87和Paracoccus等菌属可能是OXA-1、OXA-2和OXA-10的主要携带菌属;Hyphomicrobium、Thermomonas和Comamonadaceae可能是OXA-1的主要携带菌属,Caldilineaceae、Myxococcales和Pirellulaceae可能是OXA-10的主要携带菌属.