双农杆菌共转化获得无标记转pepc基因的水稻植株

利用双农杆菌/双质粒的共转化系统获得了无选择标记转pepc基因的水稻植株.采用两个农杆菌EHA105转化粳稻品种台粳9号幼胚诱导的胚性愈伤组织,其中一个农杆菌内的质粒表达载体的T-DNA区仅含有目的基因pepc,另一个的T-DNA区含有选择标记基因hpt和GUS报告基因.获得抗性愈伤的转化率为9.2%.85.3%的抗性愈伤分化成T0代株系,其中78.8%的T0代植株为GUS阳性转基因植株.PCR分析表明,在78个T0代GUS阳性植株(来源于23个抗性愈伤组织)中共有35个植株(来源于7个抗性愈伤组织)含有pepc基因,即在23个GUS阳性株系中发生共转化株系的频率为30.4%.7个共转化的株系中有5个株系自交产生后代植株中含有无标记转pepc基因植株,其比例为71.4%.无标记的转pepc基因水稻植株中PEPC活性平均比对照提高8.8倍;与非转基因对照植株相比,转pepc基因水稻植株表现出更强的光合能力.图5表3参26     

对生态系统中分离获得的菌种进行优势种群测定的方法学探讨：一株优势纤维分解菌的确定

两年内７次从同一个以杨木木屑为原料的厌氧发酵罐的高稀释度发酵液中分离出一株中温纤维分解菌，即新种阿氏梭状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｌｄｒｉｃｈｉｉ）。从细菌计数高且能反复分离获得这两个特点，可以断定阿氏梭状芽孢杆菌在该生态系统中曾是一个优势种群。经菌落及菌体形态学观察，以及用首次分离的菌株所作的多价抗血清酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），确定７次分离菌株为同一菌种，从而证实阿氏梭状芽孢杆菌在１９８６年９月至１９８８年８月间，曾是该厌氧发酵罐中每毫升含菌高达１０６─１０７的优势纤维分解菌。     

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.图5表2参18     

高选择性手性酯酶产生菌的筛选及应用

从土壤中分离得到230株产酯酶菌株，经反复筛选，从中挑选出一株酶活及选择性均较高的菌株YQ231，该菌株所产酯酶能将外消旋的酯水解为手性醇（环戊烯酮），且该酶优先水解（R）-型酯。经生理生化试验鉴定，该细菌为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）。研究了该菌株的产酶过程，结果表明：酶活在24h达最高值。同时研究了该菌株的催化特性，在反应12h时其转化率达48.8％，eep为92.3％，ees为70.3％。图3表2参9     

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参 19     

不同来源的苏云金芽孢杆菌aiiA基因表达及其抗病性分析

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)aiiA基因所编码的AiiA蛋白是一种内酯酶,可以降解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs),从而减弱致病菌产生的危害.本研究克隆了6株不同来源的苏云金芽孢杆菌aiiA基因,并对来自于苔藓(LLB15)和土壤(LLS9)的BtaiiA基因进行了生物信息学分析.结果表明,AiiA-B15分子量为27.97×103,等电点为4.59;AiiA-S9分子量为28.14×103,等电点为4.32,两者都是亲水性蛋白.AiiA蛋白具有很高的保守性,AiiA-B15和AiiA-S9同源性为90%.进化树结果表明,AiiA-B15与Bacillus thuringiensis subsp.kyushuensis进化距离最近,AiiA-S9与Bacillus cereus进化距离最近.将aiiA-B15基因克隆到pGEX-4T-3表达载体中,构建重组质粒pGEXaiiA-B15,IPTG诱导后可大量表达融合蛋白.对表达的条件进行优化.结果表明,0.6mmol/LIPTG,30℃下诱导3h为最佳诱导条件.致病性检测表明,该融合蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌具有较强的抗病作用.图13表4参23     

耐高温α-淀粉酶在溶源性枯草杆菌表达系统中的高效表达

构建了高效表达耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌表达系统,并研究了该表达系统的主要特点.通过PCR扩增由地衣芽孢杆菌的基因组DNA分离高温淀粉酶基因后,将其克隆到质粒pSG703中.然后用pSG703质粒转化含温和性噬菌体φ105MU331的枯草芽孢杆菌,通过同源重组使高温淀粉酶基因插入到溶源性枯草芽孢杆菌的染色体上,并处于φ105MU331的强启动子下游.由于高温淀粉酶基因处于噬菌体的强启动子下游,在热诱导后可以实现高温淀粉酶的高效表达,诱导后8h内分泌到培养液中的高温淀粉酶活性可以达到9.58×103u/mL.本文构建的重组高温淀粉酶表达系统具有稳定、高效和杂蛋白分泌少的特点.图5参16     

芹菜赖氨酸加苏氨酸抗性细胞系的选择

用４ｍｍｏｌ－／Ｌ浓度的赖氨酸加苏氨酸作为选择压，经相同浓度液体和固体选择培养基连续选择，从未经诱变处理的芹菜胚性愈伤组织筛选出一个稳定的赖氨酸加苏氨酸抗性细胞系并得到再生植株。抗性细胞系再生植株整株的氨基酸含量比对照组植株高１０倍左右。但是地上部分氨基酸含量，抗性细胞系再生植株比对照植株有所降低。两种植株叶片的细胞色素氧化酶同工酶谱有明显差异，抗性细胞系再生植株有４条谱带，而对照植株只有两条谱带     

赖氨酸生产废水处理技术研究

对赖氨酸生产废水处理进行了试验研究 ,探讨了各种处理方法的优劣 ,并提出了废水清洁处理技术。     

苯胺高效降解菌的筛选及共代谢机制

本实验从苯胺废水中分离筛选出一株苯胺高效降解菌,并将其命名为LS1。经过形态特征和序列相似性对比,确定LS1为粪产碱杆菌。苯胺降解能力实验结果显示,苯胺浓度为1 000 mg/L以下,停留时间延长至72 h时,菌株LS1对苯胺的降解率可达到95%以上。苯胺最佳共代谢碳源选择的实验结果显示,以1 000 mg/L为苯胺实验浓度时,抗坏血酸对菌株LS1的降解率提高最为明显,其次是甲醇、葡萄糖、淀粉、蔗糖。鉴于对方便保存和经济方面的考虑,选取葡萄糖为最佳共代谢碳源,并通过实验证明最佳投加比为苯胺与葡萄糖COD为2∶1时。