基于宏基因组技术分析MBR膜清洗后污泥中抗性基因

污水处理厂作为抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）的重要储存库,是自然界ARGs的主要来源之一.膜生物反应器（membrane bioreactor,MBR）被认为是一种能够有效去除污水处理厂中ARGs的技术工艺.MBR膜截留的废水中胶体、颗粒物、悬浮物及微生物代谢物中存在着大量的病原菌与抗性基因,而目前关于膜清洗后污泥中抗性基因的分布特征和规律尚不明确.本文采用宏基因组技术对MBR膜清洗后污泥中抗性基因进行了分析.结果显示,膜清洗后污泥中共检测出39门,其中优势菌门为Proteobacteria、Nitrospirae和Actinobacteria,优势菌属为Nitrospira、Pseudomonas和Bradyrhizobium.污泥样品含有的病原菌属占所有菌属的10.54%,其中Pseudomonas属相对丰度最高,占到所有菌属的3.94%.样品中共注释出17类ARGs和16类金属抗性基因（metal resistance genes,MRGs,15类单金属抗性基因和1类多重金属抗性基因）.其中,多药类抗生素抗性基因相对丰度最高,占49.08%.金属抗性基因中多重金属类抗性基因相对丰度最高,占该污泥样品的34.58%,单金属抗性基因中对铜的抗性基因数量最多,占19.99%.该膜清洗后污泥中微生物群落最主要的功能通路为代谢相关,并存在大量与人类疾病相关的代谢通路相关基因,其中涉及细菌耐药和细菌传染疾病的基因数量最多,分别为占人类疾病相关的代谢通路已注释序列的34.50%和16.62%.由此可见,膜清洗后污泥中蕴藏着丰富的ARGs、MRGs以及病原菌属,具有潜在的环境健康风险,需要加强对膜清洗后污泥中ARGs、MRGs以及病原菌的管控.本文为选择合适的技术工艺有效去除膜清洗后污泥中ARGs、MRGs以及病原菌提供指导.     

石油化工污染土壤中萘的生态风险评价

分别用点估计商、暴露分布/效应分布比较和基于分布的商3种评价方法对典型石油化工污染土壤中萘的生态风险进行了评价.结果表明,大庆市贴不贴纳污泡周边土壤中萘污染的生态风险较小.采用点估计商方法并应用1000倍的外推因子时,危害商小于1;采用后2种评价方法并应用100倍的评价因子时,生态风险的概率为14.1%,10%的物种受损害的概率为6.2%,基于分布的商值超出1的概率为2.1%.案例研究结果表明,运用点估计商→暴露分布/效应分布比较→基于分布的商的方法流程对石油化工污染场地进行风险评价是可行的.     

铜污染对土壤细菌群落结构及重金属抗性基因的影响

重金属Cu在土壤中长期积累会对微生物产生毒害作用,为了探究Cu污染对土壤细菌群落及重金属抗性基因的影响,本研究建立了不同Cu浓度（50、100、200、300、500、750和1000 mg·kg^-1）的土壤微宇宙,基于高通量测序和荧光定量PCR技术分析比较不同Cu浓度下培养14 d后土壤细菌群落及重金属抗性基因的变化.结果表明,当Cu浓度≤ 100 mg·kg^-1时,随着铜浓度增加细菌群落丰度和多样性增加;而Cu浓度≥ 500 mg·kg^-1时,Cu浓度的增加会导致细菌群落丰度和多样性显著降低（p<0.05）.随着Cu浓度的升高,变形菌门的相对丰度增加,酸杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度降低（p<0.05）;在属水平,溶杆菌属、黄杆菌属和Brevundimonas等13个属的相对丰度升高,而芽孢杆菌属、假单胞菌属和Subgroup_6等17个属的相对丰度降低.抗性基因检测结果显示,当Cu浓度≥ 500mg·kg^-1时,重金属抗性基因的丰度显著高于其它样品中的丰度（p<0.05）,其中,copB、copA和czcA的丰度较高,copB和czcA与Cu浓度之间呈显著正相关（p<0.001）,而copA与Cu浓度则呈显著负相关（p<0.001）.网络分析表明,抗性基因丰度的升高或降低可能是由于Cu污染对其潜在宿主影响所造成.本研究结果表明,不同Cu污染水平下土壤细菌群落重金属抗性的选择影响着群落多样性的变化,也为重金属Cu污染修复提供了理论依据.     

壬基酚和双酚A降解菌株的分离、鉴定和特性研究

对深圳某污水处理厂反硝化除磷活性污泥进行驯化,分离筛选得到一株能同时降解壬基酚(NP)和双酚A (BPA)的菌株NB-1.根据对菌株的16S rRNA基因序列分析,结合菌落和菌体形态以及生理生化特征,初步鉴定菌株NB-1为Serratia marcescens(粘质沙雷菌).通过摇瓶试验进行了菌株降解条件的优化和降解特性的探索.结果表明,菌株NB-1降解NP和BPA的最佳条件为:醋酸钠投加量为20 mg·L-1,温度为32q℃,pH值为8,接种量为2％,在该条件下,对菌株降解不同初始浓度NP和BPA的过程进行了动力学分析,结果表明,降解反应前36 h符合一级反应动力学.NP和BPA降解的最适初始浓度为10～20 mg·L-1,当底物浓度均为10 mg·L-1时,NP和BPA的去除率分别为54.2％、44.7％,BPA的去除率达到最大值;当底物浓度均为20 mg·L-1时,NP和BPA的去除率分别为56.4％、40.2％,此时NP的去除率达到最大值.     

畜禽粪便源芽孢杆菌多样性及对铜耐受性研究

芽孢杆菌制剂广泛应用于畜禽养殖和粪污处理等领域,铜作为饲料添加剂用于畜禽养殖,导致畜禽粪便中大量残留,在此压力下芽孢杆菌等会产生铜耐受性,由于芽孢杆菌的抗逆性,这种耐受性可由可移动遗传元件介导在环境中传播.本研究采集了多个规模化养殖场的牛粪、鸡粪和猪粪,从粪便中分离芽孢杆菌,通过PCR技术、最小抑菌浓度测定和全基因组测序方法,了解畜禽粪便中芽孢杆菌对铜耐受性.研究发现：(1)分离出芽孢杆菌属23种芽孢杆菌共235株.分离数量前三分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)77株,占总数的32.77%;蜡样芽孢杆菌(B.cereus)31株,占比13.19%;贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)28株,占比11.91%.(2)芽孢杆菌对铜耐受表型和基因型研究发现,铜对芽孢杆菌的MIC集中在200～400 mg·L^-1,占总数235株的77.87%(n=183),铜耐受能力较高的菌株能够达到500～600 mg·L^-1,占总数的16.17%(n=38),5株MIC达到600 mg·L^-1的菌株全部来自于猪粪...     

垃圾填埋场抗生素抗性基因初探

不同环境介质中抗生素抗性基因普遍存在,但是在垃圾填埋场中抗生素抗性基因尚无相关报道.本实验以西安江村沟垃圾填埋场为研究对象,采集不同方位不同深度垃圾样品,分析垃圾理化性质,用荧光定量PCR检测磺胺类抗生素抗性基因(sulⅠ和sulⅡ)、抗氯霉素类抗生素抗性基因(cat)、β-内酰胺类抗生素抗性基因(bla-SHV),以及四环素类抗生素抗性基因(tet W)等5种抗生素抗性基因的含量,以相关性分析垃圾理化性质与抗性基因的关联.结果表明,5种抗生素抗性基因均存在于垃圾中,基因拷贝数(以干土计)最大值分别为:(3.70±0.06)×108copies·g-1(sulⅡ)、(9.33±0.06)×106copies·g-1(sulⅠ)、(2.27±0.08)×105copies·g-1(tet W)、(3.68±0.09)×104copies·g-1(bla-SHV)和(1.39±0.10)×104copies·g-1(cat),说明垃圾填埋场是抗生素抗性基因潜在的储存库.抗性基因sulⅠ、sulⅡ和cat与含水率呈明显的正相关,同时sulⅠ和cat基因含量与p H值呈负相关.     

典型水稻土微生物RNA的提取方法比较

采用4种方法分别提取和纯化2种典型土壤微生物RNA(水稻土和旱地土),并对RNA产量和质量进行比较评价.结果表明,方法1用液氮研磨法提取的RNA提取量最高,但需要纯化后才能满足RT-PCR等后续分子生物学要求;方法2用玻璃珠破碎法提取的RNA提取量稍低,但RNA纯度较高,可以直接用于RT-PCR等后续实验;方法3用试剂盒提取的RNA纯度高,但提取量最低,成本高,且对土壤样品有选择性;方法4未能提出供试土壤的微生物RNA.选择RNA提取效果较好的方法1和方法2并应用于3种典型水稻土(紫潮泥、红黄泥、麻沙泥),结果表明,这2种方法也适合于这3种水稻土微生物RNA的提取.     

2株海洋石油降解细菌的降解能力

为实施海洋石油污染的生物治理,从厦门储油码头油污水中分离得到了2株石油降解菌.它们能够在以柴油、萘或芘为唯一碳源的培养基中生长,并适应于海洋环境的温度、pH和盐度.它们对萘都有很强的降解能力,3d内降解率可达87.53%和84.01%;7 d内对芘降解率分别为8.35%、5.37%.经16S rDNA同源性分析表明2菌株之间及其与施氏假单胞菌的同源性皆为99%;Biolog生化鉴定也表明它们为不同的菌株.通过兼并PCR扩增,序列分析发现2种菌编码完全相同的萘双加氧酶基因,该基因与其它假单胞菌的萘双加氧酶大亚基有98%同源性.     

Cloning, expression in Escherichia coli, and enzymatic properties of laccase from Aeromonas hydrophila WL-11

A strain WL-11 with high laccase activity was isolated from activated sludge collected from the effluent treatment plant of a textile and dyeing industry.It was identified as Aeromonas hydrophila by physiological test and 16S rDNA sequence analysis.A gene encoding of laccase from a newly isolated Aeromonas hydrophila WL-11 was cloned and characterized.Nucleotide sequence analysis showed an open reading frame of 1605 bp encoding a polypeptide comprised of 534 amino acids.The primary structure of the enzyme predicted the structural features characteristic of other laccases,including the conserved regions of four histidine-rich copper-binding sites.The predicted amino acid sequence showed a high homology(more than 60%) with bacterial laccases in the genome and protein databases and the highest degree of similarity(61% identity) was observed with the multicopper oxidase of Klebsiella sp.601.When expressed in Escherichia coli,the recombinant enzyme was overproduced in the cytoplasm as soluble and active form.The purified enzyme had an optimum pH of 2.6 and 8.0 for ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid) and DMP(2,6-dimethoxyphenol),respectively.The kinetic study on ABTS revealed a higher affinity of this enzyme to this substrate than DMP.     

养鸡场空气中抗性基因和条件致病菌污染特征

集约化养殖场被认为是空气环境中抗性基因和致病菌的重要来源.本研究采集了养鸡场粪便和舍内外空气样本,对其抗生素抗性基因和条件致病菌的种类进行分析,包括五类抗生素(β-内酰胺类的23个基因、四环素23个基因、喹诺酮5个基因、磺胺类5个基因和红霉素2个基因)抗性基因、5种条件致病菌(肠球菌属、大肠杆菌属、葡萄球菌属、弯曲杆菌属和产气荚膜梭状芽胞杆菌属各1个基因)以及一类整合子(int I1)特异基因;并利用荧光定量PCR对检出率较高的典型基因浓度进行检测.结果显示,空气中5类抗生素抗性基因分别检出8、7、2、3和2个,同时检测到两种致病菌.目标基因在舍内空气中的检出率小于等于粪便样本.蛋鸡和肉鸡舍内空气中总细菌基因(16S r DNA)浓度为106copies·m-3,其他典型基因浓度约104copies·m-3,且在舍外的浓度要远低于舍内.抗生素抗性基因和条件致病菌基因在空气中所占比例高于粪便,舍内高于舍外.初步研究结果表明,粪便可能是舍内抗生素抗性基因、条件致病基因以及一类整合子的重要来源.本研究结果将为集约化养殖场抗生素抗性基因和致病菌的来源分析,以及养殖场对周边空气环境污染的风险评估提供基础数据.