杂合抗菌肽LPCB在毕赤酵母中的表达条件优化

为获取能表达具有天然活性的杂合抗菌肽的重组酵母菌,确定其最佳表达条件,将构建好的重组酵母表达载体pPICZα-A-CecropinB(1～10)-Magainin2(1～12)(简称pPICZα-A-CBMA)和pPICZα-A-Lfcin-Pro-CecropinB(简称pPICZα-A-LPCB)经SacⅠ线性化处理,分别电转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,PCR扩增验证,甲醇诱导表达.采用抑菌圈法初步测定产物活性,优化杂合肽LPCB诱导时间、诱导剂浓度、诱导温度、培养基pH等表达条件,传代检测其质粒稳定性.结果显示,基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-CBMA和P.pastoris X-33/pPICZα-A-LPCB成功构建.表达产物前者抑菌活性微弱,后者抑菌活性良好.杂合肽LPCB的最佳表达条件为:25℃,pH中性培养,每24 h添加0.5%(V/V,φ)甲醇,诱导表达72 h.重组酵母菌pPICZα-A-LPCB在培养超过100代后,未发生质粒丢失.     

番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

嗜盐菌群对菲的降解及萘双加氧酶基因的表达规律

从胜利油田富集了一个能够降解多环芳烃的嗜盐菌群,通过克隆文库技术解析了菌群萘双加氧酶(ndo)基因的多样性.结果表明,该嗜盐菌群有6种ndo基因型,其中3种主要基因型(占总克隆子92.7%)与经典nah-like基因的相似度为89%.采用real-time RT-PCR等技术分析了不同盐度下菲降解过程中ndo基因的表达量、降解速率、生长曲线以及菲的生物可利用度,探索了菌群对菲的降解及ndo基因的表达规律.结果表明,当盐度由10%升高到20%,菌群完全降解100mg/L菲的时间从6d延长到9d,菌群生长的迟滞期由1d延长为3d.溶解菲的浓度在菌群生长过程中呈增加的趋势.Ndo基因的表达量在降解过程中呈先降低后随溶解菲浓度升高而升高的趋势,表明高浓度菲在初始阶段可能抑制ndo基因的表达.单因素方差分析(n=3, P>0.05)表明溶解菲浓度在10%和20%盐度下没有显著差异,表明一定范围的盐度不会影响菌群降解过程中菲的溶解度.菌群ndo基因的相对表达量在10%盐度下较在20%盐度下高,说明盐度对嗜盐菌群功能基因的表达具有抑制作用.     

Heterologous overexpression of Populus euphratica BAK1;1 gene enhanced resistance to Pst DC3000 in tobacco北大核心CSCD

BRI1-ASSOCIATED RECEPTORKINASE1(BAK1), a leucine-rich repeat (LRR) receptor protein kinase, plays a significant role in brassinosteroid (BR) signaling. Furthermore, it combines with other LRR-RLKs protein to initiate immune response in plants. The objective of this study was to (1) investigate the function of the Populus euphratica BAK1;1 gene in the resistance of transgenic tobacco to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) and (2) discuss the regulation pathway of PeBAK1;1 involved in the resistance to plant pathogen. We cloned the cDNA sequence of the P. euphratica PeBAK1;1 gene, constructed the pBI121-35S::PeBAK1;1 over-expression vector, and then transformed it into wild-type tobacco by Agrobacterium-mediated transformation to obtain PeBA K 1;1-overexpressing transgenic tobacco plants. The bioinformatic analysis showed that the PeBAK1;1 protein contained all the structural features of the plant SERK family. The phylogenetic tree showed that PeBAK1;1 has the highest sequence homology with PtBAK1. The gene expression profile results indicated that the expression of PeBAK1;1 in the root was higher than that in the leaf and stem. The wild-type tobacco plants showed an obvious susceptibility to Pst DC3000, whereas the transgenic plants exhibited enhanced resistance to Pst DC3000. Compared with that of the wild-type (WT), the real-time PCR and quantitative real-time PCR analysis revealed that the expression of pathogenesis-related genes (including PR1, PR3, PR4, and PR5), BAK1-interacting receptor kinase 1 gene, and BONZAI1 gene was upregulated in 35S::PeBAK1;1 transgenic tobacco plants. In conclusion, the PeBAK1;1 gene plays a positive regulatory role in 35S::PeBAK1;1 transgenic tobacco against Pst DC3000, which can enhance the resistance of plants to pathogen. © 2018 Science Press. All rights reserved.     

腈菌唑手性单体对雄性丽斑麻蜥肝脏代谢功能的影响

腈菌唑(MT)是一种应用广泛的手性杀菌剂,其手性对映体为(+)-腈菌唑(MT1)和(-)-腈菌唑(MT2)。为评估腈菌唑单体暴露对丽斑麻蜥(Eremias argus)肝脏代谢功能的毒性影响,研究了MT1(5 mg·kg~(-1))和MT2(5 mg·kg~(-1))暴露28 d下蜥蜴体重、肝组织病理学和代谢相关基因表达的变化。结果显示,MT1暴露组的蜥蜴体重在28 d时出现显著下降。在MT1和MT2暴露后,蜥蜴的肝组织均出现了不同程度的病理学变化。在MT1暴露下,基因CYP1A1、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A7和CYP2D3的表达水平未发生显著变化,而基因CYP2C8A的表达显著上调。在MT2暴露下,基因CYP3A4、CYP3A7和CYP2D3的表达未发生明显变化;基因CYP1A1和CYP2C8的表达显著下调;基因CYP2D6的表达显著上调。不同腈菌唑单体对蜥蜴体重、肝组织病理学以及代谢相关基因的表达影响不同,具有一定的对映选择性。     

潮汐-复合流人工湿地系统优化及对抗生素抗性基因的去除效果

抗生素抗性基因随废水排放传播扩散,对环境生物和民众健康构成严重威胁.针对废水中抗性基因的深度去除值得重点关注.在前期研究中发现潮汐流人工湿地能有效去除废水中多种氮素.本研究通过增加隔板和种植植物等方式进一步优化潮汐流人工湿地系统,并考察了工艺优化对抗性基因去除和脱氮功能微生物的影响机制.结果表明,同时增加隔板和种植植物后的潮汐-复合流人工湿地系统能有效提高抗性基因的去除效率,在增加隔板和种植植物组对7类21种抗性基因去除率最高达到83.82%~100.0%,显著高于单一增加隔板或种植植物组.从湿地基质和植物中的抗性基因绝对丰度对比可以看出,增加隔板能促进湿地基质中抗性基因量积累,而植物对抗性基因吸附也是其去除途径之一.同时,结合氮循环功能基因测序结果显示,湿地系统优化能提高基质中硝化和反硝化功能微生物物种多样性和丰富度,这与优化系统对废水中硝化量、反硝化量和总氮的去除率相对更高结果一致.     

抗生素抗性基因(ARGs)——一种新型环境污染物

抗生素的环境污染与生态毒性近年来引起了日益广泛的关注.水产养殖和畜牧业抗生素长期滥用的直接后果,很可能诱导动物体内抗生素抗性基因,经排泄后将对养殖区域及其周边环境造成潜在基因污染.抗性基因还极有可能在环境中传播、扩散.对公共健康和食品、饮用水安全构成威胁.为此,提出了将抗生素抗性基因作为一类新型环境污染物,对该类污染物在环境中的来源、潜在的传播途径以及国内外相关研究进展进行综述,指出了当前形势下我国开展环境中抗生素抗性基因污染研究的必要性,建议尽快从国家层面上系统进行抗生素抗性基因的环境污染机理与控制对策研究.     

斑鳢等鱼贝类去毒相关基因的克隆

采用RT-PCR和RACE法,克隆得到斑鳢、鲢鱼CYPlA与斑鳢HSP70基因cDNA的核心序列,序列长度分别为908 bp、902 bp、684 bp,分别编码302、300、228个氨基酸;还克隆得到斑鳢、近江牡蛎GPX基因cDNA的部分序列,长度分别为720 bp、727 bp,分别编码119、232个氨基酸.多个重要养殖水生动物的去毒相关基因的成功克隆,为水产养殖动物去毒相关基因结构、功能、表达调控研究以及今后定向筛选高食用安全保障的水产品奠定基础.     

北京蔬菜地土壤中抗生素抗性基因与可移动元件的分布特征

为揭示北京地区蔬菜土壤中抗生素抗性基因与可移动元件的分布特征应用高通量荧光定量PCR方法(HT-qPCR),选取北京3个区5个蔬菜基地进行调查研究.在蔬菜基地土壤中共检测到92～121种抗生素抗性基因,4～6种可移动元件,抗生素抗性基因及可移动元件按区分开.各蔬菜基地中共有且丰度较高的抗生素抗性基因型为:多重耐药类oprD、acrA-04和acrA-05,大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类抗生素抗性基因(MLSB)酰胺酶类fox5,万古霉素类vanC-03;共有可移动元件为intI1.蔬菜基地土壤中共检测到7种抗生素,含量较高的抗生素种类为恩诺沙星(ENR)、诺氟沙星(NOR)、土霉素(OTC)、磺胺甲噁唑(SMX).顺义区S1与S2蔬菜基地土壤中抗生素的种类与丰度均最高,依次是通州区T蔬菜基地、昌平区C2与C1蔬菜基地.相关性分析表明,蔬菜基地土壤中抗生素抗性基因丰度与抗生素丰度存在显著正相关(P 0.05).研究结果可为后续控制抗生素抗性基因的传播提供基础理论数据.     

牛粪堆肥系统环境因子对抗性基因的影响

本研究利用实时定量PCR技术检测牛粪60 d好氧堆肥过程中典型四环素类抗性基因(tet Q、tet W、tet M、tet G、tet A和tet X)和大环内酯类抗性基因(erm35、erm36、erm B、erm F、erm T和erm X)的数量变化规律,系统研究了温度、含水率、挥发性有机质(VS)含量、碳氮比(C/N)、pH值、氧化还原电位(ORP)等堆肥系统环境因子和细菌数量(TCB)对这两类典型抗生素抗性基因的影响.结果表明,堆肥升温阶段牛粪中tet Q、tet W、tet G和tet X数量分别增加1. 7、0. 3、84. 8和4. 5倍,而tet M丰度降低了83. 1%;堆肥腐熟阶段牛粪中tet G和tet X数量分别增加23. 8和11. 5倍,而tet W、tet Q和tet M数量均降低90%.整个牛粪堆肥过程中erm35、erm36、erm B、erm F、erm T和erm X丰度分别增加2. 1、430. 4、0. 6、11. 5、2. 1和49. 1倍. RDA分析表明,牛粪堆肥过程中对四环素与大环内酯类抗性基因数量影响较大的3个环境因子分别为:ORP(54. 8%)、温度(34%)和VS(11. 3%),其中ORP与erm X和erm B、温度与tet Q和erm F以及VS与tet W数量均呈明显地正相关.