方斑东风螺“急性死亡症”病原及其毒力基因研究

为明确引起方斑东风螺（Babylonia areolata）"急性死亡症"的病原及相关的毒力因子,对"急性死亡症"疫区的方斑东风螺进行了病原分离纯化鉴定、人工感染试验等,经鉴定为塔氏弧菌（Vibrio tubiashii）。本实验以4株分离自发病方斑东风螺且具有不同程度毒力的塔氏弧菌及东风螺组织样品为研究对象,根据半数致死剂量（LD₅₀）确定菌株毒力大小依次为:BBXP1>FBC1>FB20>FB13,针对17种弧菌毒力相关基因进行了检测分析,结果显示强毒株BBXP1、FBC1中的毒力基因检出率最高,携带12种毒力基因,弱毒株FB13毒力基因检出率最低,携带7种,表明弧菌的致病性可能与其携带毒力基因的数量具有相关性。其中,不耐热溶血毒素基因tlh、胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因asp、金属蛋白酶基因vtmp、几丁质外切酶基因chi36、锌金属蛋白酶基因vtpA、塔氏弧菌溶血素基因vthA在4株塔氏弧菌中检测均呈阳性,且仅在患有"急性死亡症"的东风螺组织样品中检测出,在健康的组织样品中未检测出。进一步通过实时荧光定量PCR方法检测此6种毒力基因在4株不同毒力的塔氏弧菌中的mRNA表达差异,结果显示,asp、vtpA的mRNA表达量与弧菌的毒力呈正相关,随着塔氏弧菌致病性的增强,vtpA、asp的mRNA表达量呈上升趋势,且菌株的半致死剂量LD₅₀与相对表达量具有显著相关性（r2=0.933,0.948;P < 0.05）;溶血素vthA的表达量则与弧菌的致病性呈现负相关,相关性并不显著（r2=0.2401;P < 0.05）,因此推测可能与其致病性关联不大;其它几种毒力基因的相对表达量与弧菌的毒力相关性不显著（P>0.05）,可见同种毒力因子在不同毒力的菌株中相对表达量存在差异,推测塔氏弧菌致病株在侵染螺体的过程主要由金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶发挥主导作用。