厌氧氨氧化细菌铜氧化酶异源表达及酶学分析

厌氧氨氧化细菌是在地球生物氮循环过程中具有重要意义的一类微生物,利用其脱氮性能发展的厌氧氨氧化工艺是目前最具前景的污水生物脱氮技术,但是厌氧氨氧化细菌对环境变化敏感限制了实际工程的应用,因此有必要研究参与厌氧氨氧化细菌应激机制的功能蛋白。铜氧化酶是细菌中参与细胞应激反应的一类蛋白,能够帮助细菌抵抗多种因素(如过氧化物、金属离子等)对细胞的侵害。该研究克隆了来自厌氧氨氧化细菌的铜氧化酶基因,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达,培养温度30℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度0.2 mmol/L为最佳诱导条件。对以包涵体形式存在的铜氧化酶进行纯化,经10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得知目的蛋白分子质量约为35 kD。优化了铜氧化酶的复性条件,获得了具有漆酶活性的目的蛋白,针对漆酶底物2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐的最适pH值是3,最适温度是35℃,在最适反应条件下,K_m为1 538.91μmol/L,V_max为17.76μmol/(L·min),k_cat为1.09 s^-1     

重组人干细胞因子中试工艺研究

人干细胞因子(Human stem cell factor, hSCF)是一种重要的造血细胞因子,能刺激造血细胞的生长、增生与分化.本文在重组hSCF工程菌的基础上,通过高密度发酵培养、包涵体分离纯化、变复性、SP-Sepharose FF、Source 30RPC与Q-Sepharose FF层析等技术分离纯化出具有生物学活性的重组人干细胞因子,建立了适合大规模生产重组人干细胞因子的分离纯化工艺.纯化的rhSCF纯度达98%以上,生物活性为1.0×106 IU/mg,各项质量检测指标均符合质量控制标准.该纯化工艺简单易行,一批次能制备克级样品,且产品回收率高,重复性好.     

热处理重组质粒DNA的复性及其在水环境中的降解特性

为了考察热处理后的重组DNA进入水环境后可能存在的环境风险,以pET-28b质粒为材料,以质粒相对转化效率为指标,考察了热变性重组质粒DNA的复性可能性,并在此基础上构建了人工模拟水环境系统,研究了热变性质粒DNA在水环境中的降解速率和影响因素.结果表明,热变性pET-28b质粒经过30min后,其转移活性可以得到恢复,在4～37℃之间,温度越高越有利于热变性质粒的复性.热处理过程中未被降解的质粒DNA进入水环境后,在pH值为7、8时降解速率相对较慢,在pH值为5、6、9的条件下,降解较快,但在任何pH下,1.0h后仍存在未降解的质粒DNA.水环境中的NaCl对热处理质粒DNA有一定的保护作用,而且这种作用是随着NaCl质量分数的提高而增强.进入水环境中的热变性DNA有足够的时间复性,从而可能发生基因转移.因此,这些热处理的质粒DNA进入环境后理论上存在一定的生态风险.