水稻精细胞差异表达基因RSG6的克隆和抗体制备

选用在水稻精细胞和二细胞花粉的差减文库中获得的在精细胞中表达量显著增强且可能代表新基因的EST之一 (BF4 75 2 0 7)为探针 ,筛选水稻精细胞cDNA文库 ,得到一全长为 1176bp的序列 ,其开放读码框编码 2 81个氨基酸 ,与已知蛋白质无明显同源性 ,属于一新发现的基因 ,GenBank登录号为AF4 4 2 4 90 .这是第 1次从高等植物精细胞中分离到的全长基因 .RT PCR结果证明该基因在根、叶、二细胞花粉、成熟花粉、授粉子房和精细胞中均有表达 ,但在精细胞中的表达量要高得多 ,是精细胞差异表达基因 .将此基因命名为RSG6 (ricespermgene6 ) .将RSG6的编码区克隆到表达载体pQE30上 ,构建重组质粒 .经IPTG诱导后 ,在E .coliM15 (pREP4 )中表达出了N端融合了 6×His的融合蛋白 .用纯化的融合蛋白免疫家兔 ,制得高效价、高特异性的抗体     

华溪蟹功能性重组金属硫蛋白的表达及抗血清制备

采用SUMO融合表达系统表达河南华溪蟹金属硫蛋白(Metallothionein,MT),经Ni离子螯合柱分离纯化后,用SDS-PAGE、紫外光谱扫描鉴定,并对重组MT的金属结合及清除自由基能力进行了检测.同时,利用纯化的融合蛋白SUMO-MT免疫BALB/c小鼠制备抗血清,间接ELISA检测该抗血清的效价,Western blot和免疫组化染色检测其特异性.结果表明,河南华溪蟹MT以可溶形式获得表达,经金属螯合层析纯化后分析仍具有金属结合特性和清除羟自由基的生物学功能.免疫BALB/c小鼠后获得特异性的抗MT抗血清,该抗血清具有较高的效价和良好的特异性,可识别组织MT,用于免疫组化分析.     

2,4-D完全抗原的合成及其免疫性能评价

以2,4-D为半抗原,BSA为载体蛋白,通过EDC的偶联反应条件优化试验,合成了多种结合比的完全抗原,制备了小分子环境污染物的多克隆抗体.结果表明,偶联反应优化步骤是2,4-D、BSA和EDC同时反应,4°C条件下反应18h.偶联反应可以在2,4-D的浓度为10.0～12.0 mg/mL的0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液中进行,反应缓冲体系pH控制在5.4～6.1之间.EDC的加入量低于12 mg时,采用2,4-D和多聚赖氨酸的偶联物为包被抗原.通过balb/c小鼠免疫试验评价结合比分别为6、12、18和25的完全抗原的免疫性能,结果表明结合比为12和18的完全抗原具有很好的免疫原性.其中以结合比为18的完全抗原免疫小鼠获得的抗血清对包被抗原载体的非特异性吸附低于阴性血清,2,4-D特异性血清含量高,适于作为完全抗原免疫小鼠进一步制备单克隆抗体.     

剑尾鱼卵黄蛋白原的ELISA检测

以卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv)抗血清为抗体,以纯化的卵黄蛋白原(vitellogenin,Vtg)为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测剑尾鱼(Xiphophorus helleri)雄鱼整体匀浆液中ρ(Vtg).结果表明,该方法的检测灵敏度为7.8 ng/mL,批内变异系数为5.094%,批间变异系数为5.540%,工作范围为32.5～2 000 ng/mL,在该范围内,标准曲线具有良好的线性和重复性.由于该方法可直接在1块或在不同的酶标板上准确地进行比较,因而可利用ELISA方法测定经诱导雄鱼整体匀浆液中ρ(Vtg)水平.结果显示,50 μg/L 17-β雌二醇(E₂)诱导21 d的雄性剑尾鱼有明显的Vtg产生;10 μg/L E₂诱导剑尾鱼亦有Vtg产生,但较50 μg/L E₂诱导组低;1 μg/L E₂诱导组及对照组剑尾鱼没有Vtg产生,检测孔OD450/对照OD₄₅₀(P/N)值小于2.1.      

对硫磷的人工抗原合成与鉴定

为防治病虫草害,确保农业丰收,每年有大量农药化学品施入环境中,从而使环境监测任务日趋繁重.气相色谱、液相色谱这些传统的农药残留检测手段,因其仪器昂贵,前处理过程复杂等难以满足快速监测需要.酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay简称ELISA)技术,具有设备简单、成本低廉、专一性强、灵敏度高、样品预处理简化、适于同时检测大量样品等优点.近年来已发展成为一种简单、灵敏、快速的农药残留测试技术而应用于环境监测中.     

油菜根肿休眠孢子间接酶联免疫检测法的建立

根肿病是由专性寄生菌--芸苔根肿菌感染所引起的一种严重影响十字花科植物生长的植物病害.本文针对根肿病缺乏简便、快速检测方法的问题,制备油菜根肿休眠破碎孢子抗血清,确定抗血清及酶标抗血清最佳工作浓度,优化间接酶联免疫反应条件;优化的抗血清和酶标血清的工作浓度分别为1:2000和1:1000,孢子的饱和包被浓度为107个/mL.确定休眠孢子稀释液的最低检测浓度为10个/mL,建市快速检测油菜根肿菌的间接酶联免疫吸附测定法,该方法稳定、可靠,板间误差和板内误差均小于10.0%.与9种土壤分离得到的真菌和7种土壤常见菌黑曲霉、粉红粘帚霉、立枯丝核菌、产黄青霉、绿色木霉、枯草杆菌、脓杆菌进行特异性实验,其中一种未知菌M1交叉反应率>30%,其余在8.51%～24.88%之间,真菌的交叉反应率普遍高于细菌.对已知孢子浓度的土壤进行了检测,土壤样品休眠孢子浓度的最低检测限度为103个/g.     

失去记忆性贝毒ASP酶联免疫检测方法的研究

建立了赤潮毒素失去记忆性贝毒中主要成分软骨藻酸(domoic acid,DA)的竞争酶联免疫检测方法.通过将DA偶联到蛋白载体上,免疫BALB/c小鼠,免疫数次后,得到抗DA的多克隆抗血清,以DA-OVA为包被抗原,利用抗原抗体反应,建立间接竞争酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)分析检测海水样品和海洋贝类中的赤潮毒素失去记忆性贝毒DA的方法.结果表明,该方法最低检出限10μg/L,海水样品平均回收率102.%,批内变异系数12.%;贝类样品平均回收率为111.%,批内变异系数4.8%.     

唐鱼卵黄脂磷蛋白的纯化鉴定与免疫原性分析

采用Native-PAGE和SDS-PAGE方法从性成熟雌性唐鱼(Tanichthys albonubes)卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白(Lv).已确定被纯化的唐鱼Lv在Native-PAGE(4%～7.5%)电泳中分子量(Mr)为314 ×103.用纯化的唐鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清.以Native-PAGE和SDS-PAGE制备的唐鱼Lv及裂解后的组分作为抗原所制备的抗血清,与经17β-雌二醇(E2)诱导的雄性唐鱼、去除卵巢的雌性唐鱼以及唐鱼卵巢的匀浆液能发生免疫反应,并且印迹位置与雌性特异蛋白卵黄蛋白原(Vtg)的位置相当.但是两种血清和未经E2诱导的雄鱼整体匀浆液并无反应,显示Lv及其大分子亚基的抗血清与Vtg和Lv两种蛋白是特异的.结果表明,唐鱼Lv裂解组分的抗血清可用于检测唐鱼的Vtg.图3参19     

酶联免疫吸附法测定麻疯树核糖体失活蛋白

建立了一种检测麻疯树核糖体失活蛋白(Curcin)的简便、快速的酶联免疫吸附测定法(ELISA).ELISA条件优化试验结果显示:最佳条件为costar酶标板在紫外线下照射45 min后进行包被;抗原最适稀释度为1:640倍(2.5μg/mL);curcin抗血清最适稀释度为1:12 800倍;2%封闭用山羊血清封闭120 min;二抗最适稀释度为1:5 000倍.在此试验条件下检测curcin含量,得到回归方程y=31.722x+106.88,相关系数R2=0.993 3.Curcin浓度在0.08～11μg/mL之间,曲线呈良好的线性关系.本方法的最低检测限为0.08μg/mL.高、中、低3个浓度的添加回收率分别为95.56%、102.27%、98.40%,平均回收率为98.74%.板内和板间的平均变异系数分别为4.78%和6.71%.Curcin抗血清与2种大戟科同类蛋白均无交叉反应.利用本方法成功检测了麻疯树种仁及脱毒饼粕中的curcin含量.