自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C酰化酶水解活力 |
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引用本文: | 梅婷,张大龙,冯进辉,王敏,吴洽庆,朱敦明,马延和.自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C酰化酶水解活力[J].应用与环境生物学报,2015(3):427-434. |
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作者姓名: | 梅婷 张大龙 冯进辉 王敏 吴洽庆 朱敦明 马延和 |
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作者单位: | 天津科技大学生物工程学院,教育部工业发酵微生物重点实验室;中国科学院天津工业生物技术研究所,工业酶国家工程实验室,天津市生物催化技术工程中心 |
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摘 要: | 7-氨基头孢烷酸是合成头孢类抗生素的重要中间体,利用头孢菌素C酰化酶直接催化头孢菌素C获得7-氨基头孢烷酸的一步酶法与其它方法相比更加经济和环保,其关键是获得高活性的头孢菌素C酰化酶.本文以来源于Pseudomonas sp.KAC-1的Ⅰ类头孢菌素C酰化酶(CPCase-kac)蛋白序列为模版,对其基因进行全局优化设计,人工合成目的基因,并克隆至表达载体p ET28b,实现了CPCase-kac的高效表达.但是重组蛋白CPCase-kac表达活性较低,且自剪切不彻底,表达蛋白中存在前体形式的CPCase-kac,而头孢菌素C酰化酶的自剪切和活性往往相关.对CPCase-kac分子中影响活性的Y150、Q220、F347氨基酸位点进行饱和突变发现,活力提高的突变体Q220W、Q220G其第二次自剪切明显降低,而活力提高的突变体Y150R、Y150N、Y150H、Y150W及F347H、F347Y,自剪切却没有显著影响.将这些突变进行组合,最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体Y150W/Q220G/F347Y.虽然Y150W/Q220G/F347Y突变体活性显著提高,但是其也具有Q220G较差的第二次剪切的特性.同时发现,外部条件改变可以影响CPCase前体或α’亚基的继续自剪切.这些发现为进一步提高CPCase-kac活性及应用打下了基础.
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关 键 词: | 头孢菌素C酰化酶 7-氨基头孢烷酸 头孢菌素C 定点突变 自剪切 |
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