耻垢分枝杆菌中3-甾酮-Δ~1-脱氢酶对植物甾醇转化积累9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的影响

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,分枝杆菌转化植物甾醇的过程中,9α-OH-AD的分解是导致其产率降低的一个关键因素,之前的研究已表明,3-甾酮-Δ~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ~1-dehydrogenase,KstD)在9α-OH-AD的分解过程中起着重要的作用.耻垢分枝杆菌mc~2155(Mycobacterium smegmatismc~2155)菌株基因组中存在6个编码3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因,通过对这6个脱氢酶基因分别进行外源表达和活性测定,发现只有KstD1、KstD2和KstD3具有脱氢活力;使用CRISPR-Cas12a辅助重组技术成功构建了失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株,结果显示单独失活基因kstD1能够产生9α-OH-AD,但随着转化时间的延长,9α-OH-AD会降解,无法积累,同时失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株以5 g/L植物甾醇为底物时,转化14 d内9α-OH-AD能够稳定存在,产物浓度达到2.86 g/L.可见,耻垢分枝杆菌mc~2155中kstD1基因对9α-OH-AD积累起关键作用,随着转化的进行和产物的积累,kstD2和kstD3的作用逐渐显现,同时失活3个3-甾酮-Δ~1-脱氢酶有效提高了菌种生产9α-OH-AD的稳定性和产率,本研究结果可为构建9α-OH-AD生产菌种及产业化应用奠定基础.(图6表5参30)