| 摘 要： | CBF(C-repeat binding factor)是调控植物冷驯化相关基因表达的调控转录激活因子,可与下游冷应答基因启动子的核心序列CBT/DRE元件(CCGAC)特异性地结合,启动耐寒基因的表达,提高植物的抗寒能力.为揭示播娘蒿(Descurainia sophia)的抗寒机制,研究播娘蒿转录因子Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸对启动下游抗寒基因表达的作用.首先分析Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸的疏水性,设计重叠延伸PCR引物,定点突变Ds CBF1基因;然后构建p ET32a-Ds CBF1突变体原核表达载体,通过冻融法转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达,并通过镍离子亲和层析纯化Ds CBF1突变体蛋白;最后利用化学发光法EMSA试验(Electrophoretic mobility shift assay)方法分析Ds CBF1蛋白与含有CRT/DRE元件的DNA探针之间的相互作用.EMSA试验分析显示,播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)分别突变为精氨酸R(CGT)和谷氨酸E(GAA),导致播娘蒿顺式调控因子Ds CBF1蛋白与下游冷响应基因的CRT/DRE元件结合效率出现明显下降趋势,说明播娘蒿Ds CBF1蛋白AP2区域编码氨基酸位点的突变影响了播娘蒿的抗寒能力.本研究表明播娘蒿Ds CBF1的AP2区域的57位苯丙氨酸F(TTT)和68位缬氨酸V(GTT)位点对于播娘蒿的冷驯化具有十分重要的作用.
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