应用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记技术验证含羞草根瘤菌的结瘤能力

对云南省热带及亚热带地区的含羞草根瘤菌进行了分离,选择其中40株菌为接种菌株,通过结瘤试验并采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记方法研究了其结瘤能力.经过结瘤试验,发现除菌株SWF66075和SWF66093没有结瘤外,其它38株菌株均与含羞草植物结瘤.结瘤率为95%.从结瘤试验所获根瘤中,分离得到结瘤菌株,采用全细胞蛋白SDS-PAGE分子标记对结瘤菌株与接种菌株进行了比较研究.蛋白图谱及聚类分析显示,26株接种菌株与其结瘤菌株的全细胞蛋白分子图谱完全相同,在100%的相似水平上与其结瘤菌株聚在一起,说明宿主植物所形成的根瘤确系接种菌株侵入所致,因而可将这些菌株确认为根瘤菌菌株;而SWF66012、SWF66029、SWF66044和SWF66058等12株菌株的结瘤菌株与其各自接种菌株的全细胞蛋白图谱存在较大差异,推测这12株接种菌株与其结瘤菌株可能不是同一菌株,尚不能确定它们与含羞草植物的结瘤能力,这些菌株是否为根瘤菌菌株仍需进一步验证.研究结果表明,全细胞蛋向SDS-PAGE分子标记技术是一种快速、准确地验证根瘤菌结瘤能力的方法.该方法进一步完善了结瘤试验,并初步揭示了根瘤菌的竞争结瘤能力,适用于对大量根瘤内分离菌株进行根瘤菌的证实研究.图2参28     

基于根瘤菌来源的ACC脱氨酶基因提高大豆和紫云英根瘤菌的竞争结瘤能力

根瘤菌的竞争结瘤能力提高对提高接种剂的应用效果至关重要.为提高根瘤菌的共生固氮和竞争结瘤能力,从大豆慢生型根瘤菌USDA110中扩增1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)基因和其上游调控序列,通过两亲本接合转移导入华癸中慢生根瘤菌7653R、大豆快生型根瘤菌HH103和SMH12,构建含有ACC脱氨酶的重组根瘤菌.结果显示:在土壤盆栽条件下,接种导入ACC脱氨酶的重组菌7653R,宿主植物地上鲜重、瘤数、瘤重和固氮酶活均显著增加,竞争结瘤能力提高22.6%;接种重组菌HH103,植物地上鲜重、瘤重和酶活显著增加,瘤数增加,竞争结瘤能力提高28.9%;接种重组菌SMH12,植物地上鲜重、瘤数、瘤重和酶活增加,未到达显著性,但竞争结瘤能力提高25.4%.本研究表明构建的3个重组根瘤菌具有良好的共生固氮和竞争结瘤能力,可作为有潜力的优良菌株应用到田间试验.(图10表2参32)     

与黑龙江大豆主栽品种匹配的优良根瘤菌筛选与鉴定

根瘤菌剂在大豆上能否充分发挥共生固氮效应涉及到根瘤菌的结瘤固氮能力、与大豆品种的匹配性、土壤特性等多种因素.黑龙江省是我国大豆的主产区之一,为筛选得到适于在黑龙江推广应用的根瘤菌资源,从黑龙江、河北和湖南等地区采集土壤样品,采用大豆结瘤法,从10个土样中分离获得59株大豆根瘤菌株,再依据BTB显色反应和16S r DNA分析,鉴定出36个慢生型大豆根瘤菌.沙培结果表明,有34株根瘤菌能够在大豆品种黑农61上有效结瘤;再从中选出4株共生效应较好的菌株做进一步实验.匹配实验表明,这4株菌SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3同样能与黑龙江另外16个主栽大豆品种结瘤;与不接根瘤菌的对照组相比,SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3处理的大豆的根瘤固氮酶活和生物量显著提高,且整体表型优于HN01和USDA110.土壤盆栽实验结果表明,NW5-3、SN10-3、SN7-2在黑土中具有显著的接种效果,且在10 mmol/L NH_4NO_3高氮处理下,4个优良供试菌均能够与黑农61结瘤.与不加氮素的处理相比,其中NW5-3和SN10-3形成根瘤具有近50%的固氮酶活性.本研究筛选的4个慢生型大豆根瘤菌SN2-5、NW5-3、SN7-2、SN10-3与黑龙江的主栽大豆品种具有良好匹配性能,可进一步用于黑龙江大豆产区的田间实验.     

钒钛磁铁废矿土壤中根瘤菌的捕获及其共生固氮效应

根瘤菌与豆科植物共生能提供植物氮营养、增强植株抗逆性、增加土壤氮积累因而被应用于重金属污染土壤的生物修复中,为筛选出重金属耐受性强的土著根瘤菌应用于钒钛磁铁废矿土壤的生物修复,以钒钛磁铁废矿土壤作为基质进行大豆和豇豆盆栽实验捕获根瘤内生细菌,并通过分子鉴定筛选出根瘤菌,再测试根瘤菌的共生固氮效应.大豆和豇豆的盆栽捕获实验分离获得43株根瘤内生菌,BOX-A1R PCR电泳图谱聚类分析在84%相似水平上聚类为13个群,从13个类群中选取大豆和豇豆根瘤内生代表菌株进行16SrDNA测序和系统发育树的构建,结果表明只有类群8上的两株代表菌株(ms12-11,syj1)是根瘤菌,属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).在盆栽回接实验中,ms12-11和syj1均能在贫瘠且重金属含量高的废矿土壤中与大豆和豇豆共生结瘤固氮,但ms12-11的固氮效率明显高于syj1;由于重金属的胁迫压力,播种于废矿土中的大豆和豇豆固氮效率明显低于蛭石中的大豆和豇豆固氮效率.综上表明钒钛磁铁废矿土壤中含有丰富的根瘤菌资源,能在逆境环境下与豆科植物共生固氮,增强植物抗逆性.     

用celB基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的可行性

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法，将celB标记基因分别导入了两株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中，对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明，二者之间没有显著差异．在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下，比较了二者的竞争结瘤能力；结果显示，标记菌株形成的根瘤（蓝瘤）的占瘤率与50％相比，差异不显著，为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性，测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量；结果表明，标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异．说明利用celB基因研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的，表5参7     

紫云英根瘤菌共生基因分布及其共生效应的多样性

从同一植株不同根瘤分离40株紫云英根瘤菌，所有菌株对10种抗生素的抗药性测定表明，该群体分为22个抗药类群，质粒检测显示所有公离株都含有质粒，质粒数1～4条，用快生型大豆根瘤菌USDA205质粒作参考，估测质粒Mr分布范围为83～226MU．根据图谱分析表明，该菌群可分为6个不同质粒型．各类型质粒通过与Dig-nodABC和Dig-nifHDK杂交，结果显示带有1条质粒的菌株其共生基因定位在染色体上．带有2条或2条以上质粒的菌株各拥有1条共生质粒，共生质粒Mr范围有差异，大约为117～220MU．研究结果也显示，不同质粒型的菌株其共生效应存在明显差异，其中第6质粒型的菌株共生固氮率最强，第1质粒型菌株共生固氮率较低．共生固氮能力最强的第6质粒型菌株，只占总菌数7．5％．     

四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析

为了解四川地区结瘤大豆根际土壤是否存在与紫云英、苜蓿和三叶草共生结瘤的根瘤菌及其多样性,从四川盆地采集不同种植模式下结瘤大豆根际土壤样品31份,利用紫云英、苜蓿和三叶草进行盆栽捕获试验以获得共生根瘤,从根瘤中分离纯化出根瘤菌,对其进行表型和分子鉴定;并将根瘤菌回接到紫云英、苜蓿、三叶草和大豆根际以检测根瘤菌的寄主范围.在捕获实验中,苜蓿和三叶草分别在6个土壤样品中共生结瘤,而紫云英只在2个土样中共生结瘤,并从共生根瘤中分离出14株根瘤菌;16S r DNA基因序列的相似性分析表明这14株根瘤菌均属于根瘤菌属(Rhizobium),且16S r DNA基因的系统发育树揭示它们分属于根瘤菌属的不同种;这14株根瘤菌在回接实验中都只能让捕获豆科植物结瘤,而不能让其他3种豆科植物结瘤.本研究结果表明,四川地区结瘤大豆根际土壤中的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)和三叶草根瘤菌(R.leguminosarum var.trifolii)资源较少,其与大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)分属于不同的属,且根瘤菌的回接实验进一步证明了根瘤菌的寄主专一性.     

紫云英根瘤菌的系统发育多样性

在筛选根瘤菌与不同紫云英品种高效结瘤的基础上,通过16S rRNA基因序列分析,对13株共生结瘤效果好的菌种进行了系统发育研究.结果表明,13株菌属于3个主要聚类群,分别与Mesorhizobium、Agrobacterium和Stenotrophomonas亲缘关系最为接近,种类多样性较为丰富;其中编号为ACCC13065株的菌株与S.rhizophila16S rDNA序列相似性为100%,位于γ-变形菌纲,这是除α-变形亚纲、β-变形亚纲外所发现的一类新的根瘤菌类型.     

四川盆地大豆根瘤内生细菌的分离鉴定及促生效果

以四川盆地大豆根瘤为材料,采用划线法分离内生细菌、16S rDNA PCR-RFLP分析其遗传多样性,并结合菌株促生特性和盆栽试验筛选优良促生菌.从分离获得的130株内生细菌中选取了40株细菌作为供试菌株,16S rDNA序列表明分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).以大豆为供试作物筛选出了12株具有促生能力的细菌,所有菌株均能分泌吲哚-3-乙酸(IAA),浓度达到0.353-32.404μg/mL;7株能产铁载体,活性单位为7.35%-34.31%;有11株具有溶磷能力,溶磷量达到4.26-10.6μg/mL;6株具有固氮能力.接种12株供试菌株后,玉米的农艺性状、植株全氮和全磷含量均优于单施化肥处理,其中菌株DA16-5效果最好,表现出良好的促生潜力.综上,四川盆地大豆根瘤内生菌遗传多样性丰富并且普遍具有促生能力,是重要的生物资源.     

费氏中华根瘤菌lrp基因的克隆、突变与功能

通过分子克隆技术,从费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01基因组文库中克降到一个lrp基因.该基因与已报道的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021的lrp基因在核苷酸水平上有89%相似性,在氨基酸水平上有99%相似性.利用自杀质粒pK18mob构建含有lrp基因部分片段的重组质粒,通过三亲本结合后导入原始菌株HN01中,经过同源单交换,获得发生正向插入突变的突变株GXHNLTA和反向插入突变的突变株GXHNLTB.将lrp基因ORF连接到载体pLAFR3上,获得用于互补的质粒pGXHNL100,将该质粒通过三亲本接合导入突变株中,获得互补株GXHNWA、GXHNWB.对野生型菌株、突变株、互补株进一步研究发现,在以脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸等氨基酸为唯一碳、氮源的MM培养基中培养时,突变体GXHNLTA、GXHNLTB的生长均滞后于出发菌株HN01.植株试验表明,突变菌株GXHNLTA、GXHNLB比野生菌株HN01开始结瘤的时间提前1 d,在结瘤效率、单株瘤数、瘤重、固氮酶活性方面并无显著差别.     

基于三维石墨烯去除水体中四环素

三维石墨烯具有较大的比表面积和独特的空间孔结构,为捕获抗生素提供大量的活性位点,能够促进抗生素在多孔网络结构的运输。本研究采用化学还原自组装方法制备了有序多孔结构的三维石墨烯(3DG),并将其应用于去除水体中的四环素(TC)。研究结果显示,TC在3DG的吸附过程同时符合伪二级动力学和Langmuir方程。在最佳吸附pH=6时,3DG对TC最大饱和吸附量达到322.58 mg·g^-1,并具备良好的再生性能,经过5次吸附-解吸重复试验后,3DG对水体中TC的去除率仍可达68%。因此,3DG是一种在环境分析领域具有良好应用前景的吸附材料。     

一株降解苄嘧磺隆光合细菌的分离鉴定及其降解特性

从农药厂工业废水和污泥中富集分离到一株能降解苄嘧磺隆(Bensulfuron methyl)的光合细菌PSB07-6,根据分离菌株的细胞形态结构、活细胞光吸收特征、生理生化特征以及系统发育分析将该菌初步鉴定为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris).高效液相色谱法(HPLC)测定该菌降解光合细菌培养基中苄嘧磺隆的能力,在pH为6.5的光合细菌培养基中培养5 d,对350 mg·L-1苄嘧磺隆降解率达25.03%.添加回收率为105%～112%.降解特性研究结果表明,该菌能以苄嘧磺隆为唯一碳源和氮源,降解最佳条件为30℃、pH6.5.     

Grafting increases cadmium accumulation in the post-grafting generations of the potential cadmium-hyperaccumulator Solanum photeinocarpum

ABSTRACT

To determine whether grafting increases cadmium (Cd) accumulation in the post-grafting generation of hyperaccumulator plants, the effects of grafting on Cd accumulation characteristics of post-grafting generations of a potential Cd-hyperaccumulator Solanum photeinocarpum were evaluated in pot and field experiments. The following four grafting combinations were examined: ungrafted (UG), self-rooted grafting involving one S. photeinocarpum seedling (SG), self-rooted grafting involving two S. photeinocarpum seedling developmental stages (DG), and grafting on wild potato rootstock (PG). Grafting did not induce genetic changes in S. photeinocarpum, and increased the shoot biomass and the amount of Cd extracted by the shoots of the first, second, and third generations of S. photeinocarpum (PG > DG > SG > UG). Additionally, enhanced superoxide dismutase, peroxidase, and catalase activities and increased soluble protein contents of the first post-grafting generation were observed for the DG and PG, whereas only enhanced superoxide dismutase and peroxidase activities were observed for the SG. Grafting increased the DNA methylation levels by inducing hypermethylation in the first post-grafting generation (PG > DG > SG > UG). Therefore, grafting can enhance the Cd accumulation (phytoremediation) ability of post-grafting generations of S. photeinocarpum by enhancing DNA methylation levels, especially when wild potato rootstock is used.     

一株中度嗜盐菌的分离及生物学特性

从我国内蒙古吉兰泰盐湖的样品中分离得到一株中度嗜盐细菌菌株JLT-01,研究了其形态和特性.结果显示:该菌株为杆状,革兰氏阴性,无芽孢,无荚膜,无鞭毛;最适培养温度为30℃,最适生长pH值7.5,最适生长盐度10%~12%(m/V),最适生长Mg2+浓度3.0%(m/V);能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖作为唯一碳源生长.脂肪酸成分分析表明在JLT-01中主要脂肪酸为C16:0与C18:1ω9c,含量分别为26.39%和20.30%.Tm法测定该菌的(G+C)含量(摩尔分数)为52.3%.以该菌的16S rRNA基因序列为基础构建了系统发育树;16S rRNA基因序列的序列同源性比对表明该菌与海杆菌属Marinobacter lipolyticus SM19T的同源性为98.0%,与Marinobacter属内其它菌株的同源性在96.0%~99.0%之间.DNA-DNA杂交实验分析显示:JLT-01与M.lipolyticus DSM15157的杂交率小于70%.结果表明,菌株JLT-01是海杆菌属的一个新菌株.     

Production of sexuals in a fission-performing ant: dual effects of queen pheromones and colony size

Models based on the kin selection theory predict that in social hymenopterans, queens may favor a lower investment in the production of sexuals than workers. However, in perennial colonies, this conflict may be tuned down by colony-level selection because of the trade off between colony survival and reproductive allocation. In this study, we present a survey of sexual production in colonies of Aphaenogaster senilis, a common species of ant in the Iberian Peninsula. Similar to most species that reproduce by fission, males were found in large excess compared to gynes (172:1). Sexuals were more likely to be found in queenless than in queenright (QR) field colonies. However, we also found a few gynes and numerous males in very large QR colonies. We compared these data with those available in the literature for A. rudis, a congeneric species from North America that has independent colony founding. The sex ratio in this species was only five males for each female, and sexuals were mostly found in QR nests, irrespective of colony size. We confirmed queen inhibition of sexual production in A. senilis in laboratory experiments and provide evidence that this inhibition is mediated by a nonvolatile pheromone. To seek the potential source of such a queen pheromone, we analyzed the secretions of two conspicuous exocrine glands, the Dufour’s and postpharyngeal glands (DG and PPG, respectively) in both queens and workers. Both secretions were composed of hydrocarbons, but that of DG also contained small quantities of tetradecanal and hexadecanal. The hydrocarbon profile of the DG and PPG showed notable caste specificity suggesting a role in caste-related behavior. The PPG secretions also differed between colonies suggesting its role in colony-level recognition. We suggest that in A. senilis, there are two modes of colony fission: First, in very large colonies, gynes are produced, probably because of the dilution of the queen pheromone, and consequently one or more gynes leave the mother colony with workers and brood to found a new nest. This is beneficial at the colony level because it avoids the production of costly sexuals in small colonies. However, because the queen and workers have different optima for sexual production, we hypothesize that queens tend to overproduce the pheromone to delay their production. This in turn may drive workers to leave the mother colony during nest relocation and to produce sexuals once they are away from the queen’s influence, creating a second mode of colony fission.     

中国红豆杉内生放线菌En-1的分离、鉴定及其次生代谢物的研究

采用选择性分离方法对药用植物红豆杉Taxus chinensis嫩枝和叶进行内生菌分离,得到一株放线菌En-1,经鉴定为链霉菌Streptomyces sp.;并对该菌进行液体培养条件优化、次生代谢物初筛及其抗菌活性的研究。通过添加宿主植物浸出物至En-1液体培养中以考察宿主对后者生长的影响,结果表明红豆杉叶浸出物能促进En-1的体外生长;而且En-1次生代谢物对5株供试菌中的黑曲霉具有抑制活性。通过En-1菌培养基优化并联合波谱法检测其发酵产物,显示8#配方（淀粉25 g.L-1,KNO3 1 g.L-1,K2HPO4.3H2O 0.5 g.L-1,NaCl 0.5 g.L-1,FeSO4.7H2O 0.01 g.L-1,MgSO4.7H2O 0.5 g.L-1）培养液中,En-1所产的次生代谢物最具结构多样性;同时8#配方也有利于该菌产生抗菌活性产物。本研究提示红豆杉内生放线菌可作为寻求药物先导化合物的资源菌。     

一株耐盐嗜热菌Aneurinibacillus thermoaerophilus H7的分离及其油脂降解特性

针对高盐、高油餐厨垃圾高温堆肥功能菌株缺乏的问题,以大豆油为唯一碳源,通过测定生物量、脂肪酶活性和油脂降解率,从餐厨垃圾堆积处的土壤样品中分离筛选出一株嗜热油脂降解菌H7.通过形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,对筛选的菌株进行鉴定,考察其耐盐能力、油脂降解和生长特性.结果表明,菌株H7为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus thermoaerophilus),最高耐盐浓度为30 g/L.菌株H7在油脂浓度为15 g/L的发酵培养基中发酵72 h,油脂降解率为60.11%,菌体浓度OD600为1.88,脂肪酶活性为11.65 U/mL.菌株H7可生长的温度为40-60℃,pH值为5-8,摇床转速为120-240 r/min,最适生长的温度为50℃,pH值为6,摇床转速为220 r/min.本研究获得了具有耐盐性和能降解高浓度油脂的嗜热菌株H7,可为高盐高油脂含量的餐厨垃圾堆肥提供微生物菌种资源.(图8表2参34)     

卷曲霉素产生菌的改良

以卷曲霉素（ＣＰＭ）产生菌卷曲链霉菌Ｓ．ｃａｐｒｅｏｌｕｓ４００６（效价为６６４０ｕ／ｍＬ）为出发菌,经ＵＶ诱变／五氯酚浓缩,获得一株效价为７９５０ｕ／ｍＬ的营养缺陷型菌株４０６－３５,再经ＥＭＳ诱变,筛选到一株抗５０００ｕ／ｍＬＣＰＭ、效价为８５１３ｕ／ｍＬ的突变株５－４１,经原生质体ＮＴＧ诱变处理,获得一株效价为９０５０ｕ／ｍＬ的高产菌Ｎ１３菌株Ｎ１３连续传代１０代,卷曲霉素效价保持稳定通过单因子试验和多因子正交试验,确定了菌株Ｎ１３的最佳发酵条件菌株Ｎ１３在最佳发酵条件下卷曲霉素效价为９４８３ｕ／ｍＬ,比出发菌Ｓ．ｃａｐｒｅｏｌｕｓ４００６在原有发酵条件的效价提高４２８％     

一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化

从腐烂的苹果表皮筛选到一株碱性果胶酶的高产菌株,命名为WSHB04-02.分离菌株为革兰氏阳性细菌,有芽孢,菌落颜色为乳白色.分离菌株WSHB04-02的16SrDNA全序列分析表明,该菌株与Bacillussubtilus具有99%的相似性,并与其他13株产碱性果胶酶菌株的16SrDNA结果进行同源性分析,并构建系统发育树.发现菌株WSHB04-02在不含果胶类物质与Mg2 的培养基上能高产碱性果胶酶,在优化的培养条件下,碱性果胶酶的酶活达到34U/mL,在国内还未见报道.图6表2参15     

Selective pseudosolubilization capability of Pseudomonas sp. DG17 on n-alkanes and uptake mechanisms analysis

Pseudosolubilized ability of Pseudomonas sp. DG17 on n-alkanes, role of biosurfactants in n-octadecane uptake and trans-membrane transport mechanism of n-octadecane were studied by analyzing amount of pseudosolubilized oil components in water phase, and the fraction of radiolabeled ¹⁴C n-octadecane in the broth and cell pellet. GC-MS results showed that pseudosolubilized oil components were mainly C₁₂ to C₂₈ of n-alkanes. In n-octadecane broth, pseudosolubilized n-octadecane could be accumulated as long as pseudosolubilized rate was faster than mineralization rate of substrate, and the maximum concentration of pseudosolubilized n-octadecane achieved to 45.37 mg·L^?1. All of these results showed that Pseudomonas sp. DG17 mainly utilized alkanes by directly contacting with pseudosolubilized small oil droplets in the water phase. Analysis of ¹⁴C amount in cell pellet revealed that an energy-dependent system mainly controlled the trans-membrane transport of n-octadecane.