用celB基因检测慢生花生根瘤菌竞争性的可行性

采用大肠杆菌和根瘤菌接合的方法，将celB标记基因分别导入了两株慢生型花生根瘤菌Spr3-5和Spr4-5中，对出发菌株和标记菌株的代时测定结果表明，二者之间没有显著差异．在标记菌株与出发菌株等量接种的前提下，比较了二者的竞争结瘤能力；结果显示，标记菌株形成的根瘤（蓝瘤）的占瘤率与50％相比，差异不显著，为了研究标记菌株与出发菌株的固氮有效性，测定了标记菌株与出发菌株各自共生植株的干重、全氮和叶绿素含量；结果表明，标记菌株与出发菌株的这3项指标之间没有显著差异．说明利用celB基因研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力是可行的，表5参7     

慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关系的研究

选用包括6株花往根瘤菌[Bradyrhizobium sp.(Arachis)]在内的13株慢生根瘤菌，进行了6种豆科植物结瘤试验及共系统发育分析。研究结果表明，慢生根瘤菌与试验的豆科宿主植物间普遍存在交叉结瘤，还发现有些菌株在原宿主外的豆科植物根部形成类根瘤的现象。16S rDNA和23S rDNA的PCR－RFLP分析揭示出这些菌株rDNA基因的差异性，不同宿主来源的慢生根瘤菌株可以同属一个rDNA类型，而从同一宿主中分离的根瘤菌菌株可分属多种不同的rDNA类型，研究结果表明，采用rDNA PCR-RFLP等遗传背景分析的手段，可能筛选出广谱的根瘤菌力株，表4参8。     

慢生根瘤菌DG的分离、鉴定及其与降香黄檀的共生关系

从大果紫檀根瘤中分离到一株慢生型根瘤菌DG,通过其形态特征观察、保守基因序列分析以及生物学特性研究等方面进行种类鉴定,通过结瘤试验了解DG与降香黄檀的共生关系,并探讨其共生固氮能力.16S rRNA、nifH和dnaK系统发育结果表明,该菌株与Bradyrhizobium elkanii同源性最高.菌株DG与B,elkanii USDA76T在碳源利用、抗生素抗性、耐受NaCl等生物学特性上基本一致,而且还能在pH 10.0下良好生长.结瘤试验显示,菌株DG能在降香黄檀根部结瘤;接种DG的降香黄檀幼苗植株的株高、干重以及全氮含量(P<0.05)显著高于对照处理,表明DG能与降香黄檀形成良好的共生关系,且具有高效的固氮能力.图4表2参27     

四川地区结瘤大豆根际土壤中紫云英、苜蓿和三叶草根瘤菌的多样性分析

为了解四川地区结瘤大豆根际土壤是否存在与紫云英、苜蓿和三叶草共生结瘤的根瘤菌及其多样性,从四川盆地采集不同种植模式下结瘤大豆根际土壤样品31份,利用紫云英、苜蓿和三叶草进行盆栽捕获试验以获得共生根瘤,从根瘤中分离纯化出根瘤菌,对其进行表型和分子鉴定;并将根瘤菌回接到紫云英、苜蓿、三叶草和大豆根际以检测根瘤菌的寄主范围.在捕获实验中,苜蓿和三叶草分别在6个土壤样品中共生结瘤,而紫云英只在2个土样中共生结瘤,并从共生根瘤中分离出14株根瘤菌;16S r DNA基因序列的相似性分析表明这14株根瘤菌均属于根瘤菌属(Rhizobium),且16S r DNA基因的系统发育树揭示它们分属于根瘤菌属的不同种;这14株根瘤菌在回接实验中都只能让捕获豆科植物结瘤,而不能让其他3种豆科植物结瘤.本研究结果表明,四川地区结瘤大豆根际土壤中的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)和三叶草根瘤菌(R.leguminosarum var.trifolii)资源较少,其与大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)分属于不同的属,且根瘤菌的回接实验进一步证明了根瘤菌的寄主专一性.     

基于根瘤菌来源的ACC脱氨酶基因提高大豆和紫云英根瘤菌的竞争结瘤能力

根瘤菌的竞争结瘤能力提高对提高接种剂的应用效果至关重要.为提高根瘤菌的共生固氮和竞争结瘤能力,从大豆慢生型根瘤菌USDA110中扩增1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)基因和其上游调控序列,通过两亲本接合转移导入华癸中慢生根瘤菌7653R、大豆快生型根瘤菌HH103和SMH12,构建含有ACC脱氨酶的重组根瘤菌.结果显示:在土壤盆栽条件下,接种导入ACC脱氨酶的重组菌7653R,宿主植物地上鲜重、瘤数、瘤重和固氮酶活均显著增加,竞争结瘤能力提高22.6%;接种重组菌HH103,植物地上鲜重、瘤重和酶活显著增加,瘤数增加,竞争结瘤能力提高28.9%;接种重组菌SMH12,植物地上鲜重、瘤数、瘤重和酶活增加,未到达显著性,但竞争结瘤能力提高25.4%.本研究表明构建的3个重组根瘤菌具有良好的共生固氮和竞争结瘤能力,可作为有潜力的优良菌株应用到田间试验.(图10表2参32)     

与黑龙江大豆主栽品种匹配的优良根瘤菌筛选与鉴定

根瘤菌剂在大豆上能否充分发挥共生固氮效应涉及到根瘤菌的结瘤固氮能力、与大豆品种的匹配性、土壤特性等多种因素.黑龙江省是我国大豆的主产区之一,为筛选得到适于在黑龙江推广应用的根瘤菌资源,从黑龙江、河北和湖南等地区采集土壤样品,采用大豆结瘤法,从10个土样中分离获得59株大豆根瘤菌株,再依据BTB显色反应和16S r DNA分析,鉴定出36个慢生型大豆根瘤菌.沙培结果表明,有34株根瘤菌能够在大豆品种黑农61上有效结瘤;再从中选出4株共生效应较好的菌株做进一步实验.匹配实验表明,这4株菌SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3同样能与黑龙江另外16个主栽大豆品种结瘤;与不接根瘤菌的对照组相比,SN2-5、NW5-3、SN7-2和SN10-3处理的大豆的根瘤固氮酶活和生物量显著提高,且整体表型优于HN01和USDA110.土壤盆栽实验结果表明,NW5-3、SN10-3、SN7-2在黑土中具有显著的接种效果,且在10 mmol/L NH_4NO_3高氮处理下,4个优良供试菌均能够与黑农61结瘤.与不加氮素的处理相比,其中NW5-3和SN10-3形成根瘤具有近50%的固氮酶活性.本研究筛选的4个慢生型大豆根瘤菌SN2-5、NW5-3、SN7-2、SN10-3与黑龙江的主栽大豆品种具有良好匹配性能,可进一步用于黑龙江大豆产区的田间实验.     

四川盆地大豆根瘤内生细菌的分离鉴定及促生效果

以四川盆地大豆根瘤为材料,采用划线法分离内生细菌、16S rDNA PCR-RFLP分析其遗传多样性,并结合菌株促生特性和盆栽试验筛选优良促生菌.从分离获得的130株内生细菌中选取了40株细菌作为供试菌株,16S rDNA序列表明分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).以大豆为供试作物筛选出了12株具有促生能力的细菌,所有菌株均能分泌吲哚-3-乙酸(IAA),浓度达到0.353-32.404μg/mL;7株能产铁载体,活性单位为7.35%-34.31%;有11株具有溶磷能力,溶磷量达到4.26-10.6μg/mL;6株具有固氮能力.接种12株供试菌株后,玉米的农艺性状、植株全氮和全磷含量均优于单施化肥处理,其中菌株DA16-5效果最好,表现出良好的促生潜力.综上,四川盆地大豆根瘤内生菌遗传多样性丰富并且普遍具有促生能力,是重要的生物资源.     

饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌的分离及多样性

从生长在湖北省几种不同土壤中两类饭豆(Vigna umbellata L.)的根瘤中分离、纯化并通过结瘤试验筛选出26株饭豆根瘤菌；对这些菌株和来自其它种属的8个参比菌株的培养特性、生长速度、耐酸碱性、生长最终pH值、耐盐性、天然抗药性、碳源和氮源的利用及部分快生型菌株质粒图谱进行了系统的比较研究，并通过聚类分析得到数值分类树状图谱。结果发现，分离自不同类型土壤中的饭豆根瘤菌具有较大的多样性，在77％的相似水平上，形成了三大类群，群Ⅰ为慢生型菌群，群Ⅱ与群Ⅲ为快生型菌群，在80％相似水平上各群又可进一步划分为不同亚群，而且亚群中部分菌株的相似性与地理来源有相关性。图2表4参13。     

钒钛磁铁废矿土壤中根瘤菌的捕获及其共生固氮效应

根瘤菌与豆科植物共生能提供植物氮营养、增强植株抗逆性、增加土壤氮积累因而被应用于重金属污染土壤的生物修复中,为筛选出重金属耐受性强的土著根瘤菌应用于钒钛磁铁废矿土壤的生物修复,以钒钛磁铁废矿土壤作为基质进行大豆和豇豆盆栽实验捕获根瘤内生细菌,并通过分子鉴定筛选出根瘤菌,再测试根瘤菌的共生固氮效应.大豆和豇豆的盆栽捕获实验分离获得43株根瘤内生菌,BOX-A1R PCR电泳图谱聚类分析在84%相似水平上聚类为13个群,从13个类群中选取大豆和豇豆根瘤内生代表菌株进行16SrDNA测序和系统发育树的构建,结果表明只有类群8上的两株代表菌株(ms12-11,syj1)是根瘤菌,属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).在盆栽回接实验中,ms12-11和syj1均能在贫瘠且重金属含量高的废矿土壤中与大豆和豇豆共生结瘤固氮,但ms12-11的固氮效率明显高于syj1;由于重金属的胁迫压力,播种于废矿土中的大豆和豇豆固氮效率明显低于蛭石中的大豆和豇豆固氮效率.综上表明钒钛磁铁废矿土壤中含有丰富的根瘤菌资源,能在逆境环境下与豆科植物共生固氮,增强植物抗逆性.     

干旱地区几种豆科植物根瘤菌的数值分类和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳分析

从新疆、内蒙干旱地区苜蓿属、草木樨属、锦鸡儿属植物的根瘤中分离出５４株根瘤菌，对其中４８株根瘤菌和２２株参比菌一起进行了数值分类研究，在８５％的相似性水平上，未知菌分为３个不同于已知种的新群．另加入６株分离自锦鸡儿属植物的根瘤菌，共７６株菌进行了全细胞蛋白ＳＤＳＰＡＧＥ分析，在８０％的相似性水平上，已知菌相应成群，未知菌除ＸＪ９６３４２在６８％的相似性水平上和群５、６、７、８、Ｒ．ｇａｌｅｇａ聚群外，其余未知菌则分布在４、５、６、７、８、９、１０七个群中．群４中所有菌株属于数值分类的群１；群６中有３株菌属于数值分类的群３；群９中有８株菌为数值分类群２的菌株．反映了两种方法在分类上得到的结果比较近似．     

紫云英根瘤菌共生基因分布及其共生效应的多样性

从同一植株不同根瘤分离40株紫云英根瘤菌，所有菌株对10种抗生素的抗药性测定表明，该群体分为22个抗药类群，质粒检测显示所有公离株都含有质粒，质粒数1～4条，用快生型大豆根瘤菌USDA205质粒作参考，估测质粒Mr分布范围为83～226MU．根据图谱分析表明，该菌群可分为6个不同质粒型．各类型质粒通过与Dig-nodABC和Dig-nifHDK杂交，结果显示带有1条质粒的菌株其共生基因定位在染色体上．带有2条或2条以上质粒的菌株各拥有1条共生质粒，共生质粒Mr范围有差异，大约为117～220MU．研究结果也显示，不同质粒型的菌株其共生效应存在明显差异，其中第6质粒型的菌株共生固氮率最强，第1质粒型菌株共生固氮率较低．共生固氮能力最强的第6质粒型菌株，只占总菌数7．5％．     

快生型大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)内源质粒在培养及共生过程中的稳定性

以湖北洪湖公离的快生型大豆根瘤菌为材料，考察了它们的内源质粒在培养过程及共生过程中的稳定性．结果表明，所有供试菌株的质粒在培养条件下比较稳定，传代50次后没有明显变异．对其中2个菌株与4种不同的大豆宿主共生过程中质粒的稳定性研究，发现HA12－1－12的共生质粒和隐性质粒高度构定，HA7－2－2的质粒却发生了不同程度的变异．质粒检测的结果及RFLP分析表明，HA7－2－2共生质粒的稳定性高于隐性质粒，而且共生质粒上携带的nodDABC和nifHDK基因相当保守，不易受宿主的影响而产生变异．盆栽试验的结果也说明，虽然HA7－2－2的内源质粒在共生过程中发生了遗传重排，但它的共生性状没有明显的变异．     

White locoweed toxicity is facilitated by a fungal endophyte and nitrogen-fixing bacteria

Mutualistic interactions with fungal endophytes and dinitrogen-fixing bacteria are known to exert key biological influences on the host plant. The influence of a fungal endophyte alkaloid on the toxicity of a plant has been documented in Oxytropis sericea. Oxytropis sericea is a perennial legume responsible for livestock poisoning in western North America. Livestock poisoning is attributed to the alkaloid swainsonine, which is synthesized inside the plant by the fungal endophyte Embellisia sp. In this study, the ability of Oxytropis sericea to form a dinitrogen-fixing symbiosis with Rhizobium and the effects of this symbiosis on the production of swainsonine by Embellisia sp. were evaluated in a greenhouse environment. Seeds of O. sericea were grown in plastic containers. Twenty-week-old O. sericea seedlings were inoculated with four strains of Rhizobium. Twenty weeks after inoculation, plant growth and root nodulation by Rhizobium were measured. Dinitrogen fixation was confirmed using an acetylene reduction assay (ARA) on excised root nodules. Dry leaves were analyzed for swainsonine content. A second set of plants was treated with fungicide to evaluate the effect of reduced fungal endophyte infection on plant growth and swainsonine production. All inoculated plants produced indeterminate nodules. The ARA indicated that 98% of the excised nodules were fixing dinitrogen. Rhizobium-treated plants had greater swainsonine concentrations than the non-inoculated controls. Plants that established from seeds treated with fungicide had lower biomass than non-fungicide-treated controls and plants treated with foliar fungicide. Plants treated with foliar fungicide and the controls had greater swainsonine concentrations than the plants that received seed fungicide. This greenhouse study is the first report of nodulation and dinitrogen fixation in O. sericea. It also demonstrates that dinitrogen fixation increases the production of swainsonine in O. sericea plants infected with Embellisia sp. Results from this study suggest that dinitrogen fixation affects swainsonine production and has the potential to support the symbiosis between Embellisia sp. and O. sericea when soil nitrogen is limited. Oxytropis sericea competitiveness appears to be facilitated by an ability to simultaneously associate with Rhizobium and a fungal symbiont.     

基于rpoC1基因的微囊藻属分子系统学研究

测定了广东省9个水库4株铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa、5株水华微囊藻M.flos-aquae和4株未定种微囊藻rpoC1基因部分序列,结合GenBank下载的日本5个水体11株铜绿微囊藻、5株绿色微囊藻M.viridis和5株惠氏微囊藻M.wesenbergii间源序列,进行序列分析.结果显示,34株微囊藻存在21种基因型,序列相似性达97.6%～100%.在邻接树上不同形态种和不同地理来源的藻株混杂在一起,没有形成明显的谱系结构和地理结构:同一形态种藻株可能具有不同的基因型,而相同基因型的藻株可能是不同的形态种;从同一水体中分离的微囊藻具有不同的形态种和不同的基因型,而不同水体分离的微囊藻有时又具有相同基因型,表明rpoC1基因序列无法区分形态种和地理株,支持Kondo和Otsuka提出的暂将铜绿微囊藻、水华微囊藻、惠氏微囊藻和绿色微囊藻等归为铜绿微囊藻复合种的分类处理.     

利用枯草芽孢杆菌株间原生质体融合进行差异表型遗传重组分析的研究

枯草芽孢杆菌D100和枯草芽孢菌TN179同为枯草芽孢杆菌Ki－2－132的两个不同菌株，具有明显的表型差异．它们的融合子D279兼有两亲本的遗传性状，能够在常规培养条件下稳定遗传．但经过EMS处理后，即产生形状与各自亲本相似，且伴随菌落颜色、菌体形状和一些生理变化的分离物．从这些分离物的表型改变，得出了基因及连锁的一些遗传值息．     

Biotoxizitätstests mit PAK

There is great need for toxicity tests with higher plants for the investigation and monitoring of chemicals in the environment — especially for tests which are quick, easy, and inexpensive. Such tests should add to and improve current guidelines, e.g., OECD- and BBA-Guidelines. This article describes the nodulation of leguminous plants withRhizobium bacteria used in a bioassay with polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). Plants growing on a solid medium were exposed simultaneously to bacteria and PAH. This axenic culture system allows to observe the impact of PAH on plant growth and the interaction between plant and bacteria (nodulation). Dose-response-experiments indicated that nodulation measured as number of nodules per plant, was more sensitive to the inhibition by PAH than other plant growth parameters.     

兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的多样性及抗性研究

对兰坪铅锌尾矿区自然发生的植物进行调查,共发现18种植物,分属于10科。对野豇豆（Vigna vexiauata（Linn.）Bench.）、长波叶山蚂蝗（Desmodium sequax Wall.）、三叶草（Trifolium pratense Linn.）、白刺花（Sophora davii（franch.）Skeels）、密花序黄芪（Astragalus forrestii Simpson.）、美丽胡枝子（Lespedeza Formosa（Vog.）Koehne.）6种8株豆科植物根瘤进行根瘤菌的分离纯化,共得到419株细菌,经镜检初步确定有94株为根瘤菌。对其中31株根瘤菌的淀粉水解、糖发酵等12项生理生化指标进行测定,并以平均连锁法进行聚类分析。结果表明,兰坪铅锌尾矿区31株根瘤菌在50%的相似水平上可分为6个类群,其表型特性存在明显差异,同一种植物中可能存在不同代谢类型的根瘤菌,同一种代谢类型的根瘤菌也可与不同植物共生。抗逆性测定结果表明,菌株（4G.7、5.4.3、7.4.3）对温度、（4A.12、4G.7、4G.10、5.4.3）对pH、（3.7.9、5.4.3）对盐、（3.7.19、4A.12、6.1.2、6.1.13）对抗生素有较强耐受性或抗性,大多数菌株能在较宽的温度、盐度和pH范围内生长。     

不同宿主植物根瘤Frankia及其生物学特性

对从木麻黄、杨梅、桤木和胡颓子等宿主植物根瘤中获得的19株分离菌的离体培养形态特征、生理特性和交叉侵染特性等进行了比较分析.结果表明,各分离菌均有Frankia属所特有的分枝状菌丝、孢囊、泡囊或串珠状菌丝等形态结构;细胞壁类型多属胞壁Ⅲ型,生理类型多属B型,无氮诱导培养下都具有同氮酶活性,在BAP、JA或S培养液中菌体生长较好,以吐温-80和酪蛋白水解物为最佳碳、氮源.但不同宿主分离菌的形态和培养特征差异明显,木麻黄属分离菌菌丝较粗,孢囊数量较少,在BAP培养液中多旱荔肉白絮状颗粒沉淀;杨梅属菌丝较细,孢囊数量较多,在BAP培养液中多是浅红色颗粒沉淀;桤木属和胡颓子属的菌体形态特征在BAP培养液中与木麻黄属的相似,但桤木属菌丝较细,胡颓子属的菌丝较粗.根据回接及交叉侵染特性可将分离菌分为2个宿主特异类群:能侵染木麻黄苗木的木麻黄类群;只侵染原宿主并能在杨梅属、胡颓子属和桤木属间相互侵染,但不能使木麻黄属苗木结瘤的杨梅-桤木-胡颓子类群.图2表5参19     

Performance of seed germination and growth of Vicia faba L. in fly ash amended soil

The performance of Vicia faba L. in soil amended by different concentrations of fly ash has been studied. The parameters considered are seed germination, growth behaviour and nodulation frequency of the plant. Results revealed that while fly-ash amendment to the soil improved the growth performance at initial stages with application of lower concentrations, it was inhibitory at higher exposure concentrations. Although there was no difference in survival rates, but the seedling growth was reduced in comparison to control plants. Fly ash delayed the nodulation as lesser number of nodules was recorded at higher amendments. Results suggested feasibility of growing V. faba in fly ash contaminated area.