eTM、microRNA319及其调控靶标在龙眼体胚发生早期的表达模式

MicroRNA319作为最保守的miRNA家族之一,在植物器官形态建成、激素信号转导、抵抗外界胁迫等途径中均有重要作用.为了解miR319在植物体胚中的调控途径,利用龙眼转录组数据库筛选miR319成熟体(miR319)和前体序列(pre-miR319),并通过DNAMAN 6.0和Mfold分析miR319的定位和pre-miR319的二级结构;进而采用TAPIR和psRNAtarget预测选定的miR319成员的内源诱捕靶标(endogenous target mimics,eTM)及候选靶标,并通过RLM-RACE验证靶标裂解位点,最后分析eTM、miR319及其靶标在龙眼体胚发生早期的表达模式.结果显示,龙眼4个miR319成员有1个定位于miR319a scafflod517,有3个定位于miR319a scaffold225.因此,以miR319a scaffold225为研究对象,将其命名为pre-miR319a,其上的成熟体分别命名为miR319a-3p.1、miR319a-5p.1和miR319a-5p.2.裂解位点显示龙眼miR319a 3个成员中,miR319a-3p.1的靶基因为TCP2和TCP4(Dlo_022819.1,Dlo_026743.1),miR319a-5p.1的靶基因为吲哚-3-甘油磷酸合成酶(IGS)和ABI3-5抑制因子,miR319a-5p.2未验证到靶基因.qPCR显示,在龙眼早期体胚发生过程中,miR319a 3个成员的表达模式基本一致,呈显著上调趋势.另外,除eTM8637外,其余eTM的表达模式与其相应的miR319a成员基本呈现为负相关趋势,均为下调趋势. miR319a-3p.1与其靶基因基本呈现为负调控趋势,miR319a-5p.1与ABI3-5抑制因子在龙眼早期体胚发生后期呈现负调控,与IGS没有明显负相关.本研究初步验证了"eTM-miR319a-靶基因"信号途径可能参与到龙眼早期体胚发生的形态建成.(图4表3参46)     

龙眼miR156家族及其调控靶标SPL的生物信息学和表达模式

为了解miR156基因家族的进化特性及其在龙眼早期体胚发生过程中的调控作用,对植物miR156家族成员的成熟体和前体序列进行多重比对和进化特性分析,并对龙眼miR156基因家族成员进行了前体(pre-miRNA)二级结构预测、靶基因预测及裂解位点验证,利用qPCR技术探究龙眼体胚发生早期miR156a与靶基因SPL6/9/16调控模式.结果表明,龙眼miR156家族含有13条成熟体序列和6条前体序列.Mfold预测显示,pre-miR156家族6个成员的序列均能形成典型稳定的茎环二级结构,它们的最小折叠自由能(ΔG)在-43.30--62.60 kal/mol;成熟序列的碱基保守性高.系统发育进化树分析显示,龙眼miR156家族与水稻、拟南芥的miR156亲缘关系更为接近.靶基因预测显示,龙眼miR156a的靶基因是SPL2、SPL6、SPL9、SPL16、SPL18;利用改良的RLM-RACE在龙眼愈伤组织中检测到SPL6/9/16的断裂片段,miR156a在与靶基因mRNA互补的第10个核苷酸处切割靶标mRNA.实时荧光定量PCR显示,在龙眼体胚发生早期miR156a在0-9 d表达平稳,仅在球形胚(globular embryos,GE)阶段显著下调,SPL6/9/16表达量持续上调,在GE阶段表达量最高,提示SPL6/9/16的大量积累对龙眼球形胚形态建成具有重要作用.本研究表明植物miR156基因家族成熟体序列高度保守,且miR156a的下调表达与靶基因SPL6/9/16的大量积累可能对龙眼球形胚的建成具有重要意义.(图7表2参22)     

龙眼miR167家族分子特性及其潜在靶标在体胚发生早期的表达模式

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR167家族在体胚发生早期的转录水平.结果显示,龙眼miR167前体序列存在一个长为20 nt的重叠区域,miR167b的中间序列区域和3’端与此区域存在多个碱基差异;龙眼miR167前体成员均能形成茎环结构,且最小折叠自由能介于-79.95--46.90 Kal/mol之间;分子进化树显示龙眼miR167前体成员分别与番木瓜(Carica papaya)、番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)和大豆(Glycine max)亲缘关系最近,miR167a、c、d、f在成熟体进化树中聚于同一支,靶标预测结果显示它们可能调控6个相同的靶基因,即E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)、AIRP2,MYB转录因子和生长素应答因子(ARF6、ARF8、ARF6-3),miR167b则单独分布于另一支中,并可能调控2个特异靶标,即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)和细胞周期素(cyclin-C1-2-like);qPCR结果显示dlo-miR167a、c、d的表达均呈上调趋势,dlo-miR167d、f在3个阶段的表达水平较低;FPKM值显示ARF6/8、BB在体胚发生早期的表达模式与dlo-miR167a、c、d趋于一致,与AIRP2呈负相关.本研究表明在体胚发生早期ARF6/8和BB可能不受龙眼miR167的靶向调控,miR167可能通过靶向AIRP2参与早期体胚发生的形态建成,提示龙眼miR167基因功能的协同性和独立性并存.(图9表3参54)     

龙眼GRF家族全基因组鉴定及表达模式

生长调节因子(growth regulating factor,GRF)是植物体内特有的一种转录因子,在植物生长发育、渗透胁迫中发挥重要的作用.基于龙眼基因组和转录组数据,采用生物信息学分析的方法对龙眼GRF(DlGRF)家族成员进行鉴定命名;分析其基本理化性质、基因结构、蛋白结构域、启动子序列顺式作用元件;构建系统进化树、预测可能直接调控DlGRF的miRNAs;分析DlGRF家族在龙眼非胚性及胚性培养物、组织器官、光质与激素处理下的表达水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DlGRF的表达模式.结果显示,龙眼DlGRF家族包含9个成员,均含有QLQ和WRC保守结构域;包含2-5个外显子,以3个为主;分布于四大分支上,与甜橙、拟南芥GRF亲缘关系较近;DlGRF蛋白包含7个motif;启动子序列中包含众多光响应、激素应答、厌氧感应、胁迫响应及其他与生长发育相关的作用元件.转录组结果显示,DlGRF家族8个成员在球形胚阶段表达量高于其他阶段;各成员均在种子中有较高表达量,对蓝、白光及激素响应明显. qRT-PCR结果显示,DlGRF1-2、DlGRF2-1、DlGRF2-2、DlGRF4、DlGRF5-1及DlGRF7在球形胚阶段表达量最高;DlGRF1-1、DlGRF1-2、DlGRF2-2及DlGRF5-2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和赤霉素(GA3)等激素处理中表达上调.此外,DlGRF可能受miR396a调控,调控方式为裂解靶标.本研究表明DlGRF在进化过程中保守性较高,且可能受到蓝光和激素的诱导,参与龙眼非胚性及胚性培养物尤其是球形胚及种子发育形成的过程.(图6表3参42)     

野生蕉miR395a前体克隆与进化特性及启动子分析

植物miR395参与硫代谢调控,并在应答逆境胁迫等方面起重要调控作用.为了解香蕉miR395的分子特性和进化规律,在参考香蕉基因组信息的基础上,结合RT-PCR技术,从三明野生蕉(Musa itinerans)叶片中获得81 nt miR395a前体序列,包含21 nt miR395a成熟体序列.进化特性分析表明,植物miR395a前体存在于27个物种中,野生蕉pre-miR395a序列与双子叶耧斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)最为接近,与单子叶的水稻、玉米、高粱最远,表明野生蕉pre-miR395a的起源比较特殊;前体序列长度差异较大(57-226 nt);miR395a成熟体序列分析发现,来自5p臂上的miR395a序列特异性较大.野生蕉miR395a前体能形成典型的发卡结构,miR395a成熟体位于前体的3p臂上.转录起始位点分析表明,野生蕉pri-miR395a转录起始区域位于-87 bp--38 bp,A为转录起始位点.启动子顺式作用元件预测分析表明,野生蕉miR395a启动子包含多个激素、胁迫、生物钟及光响应元件,可能与响应胁迫密切相关.qPCR检测结果也发现miR395a的表达量在低温胁迫下极显著下调,表明响应低温胁迫.综上表明三明野生蕉在响应低温胁迫过程中miR395a起着重要调控作用,这对于进一步研究野生蕉miR395a在低温胁迫中的作用机制具有参考价值.     

龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

为了解龙眼漆酶(DlLAC)家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示:DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.     

龙眼miR159家族成员进化特性及时空表达

为了解植物miR159家族成员的进化特性及其在不同组织部位的表达规律,以龙眼miR159家族为例对miRNA家族进行探讨.通过龙眼miR159家族前体与成熟体序列比对、前体二级结构预测、系统发育进化树的构建、靶基因预测及实时荧光定量等手段,对龙眼miR159基因家族进行研究.结果显示:龙眼miR159家族存在7个前体成员和6个成熟体成员,序列比对发现5个成熟体可以高度定位于7个前体序列中一个共有的、约20个碱基的保守区域,推测miR159成熟体主要来源于该区域;进一步分析发现6个成熟体序列中仅2个可定位于pre-MIR159中.mfold预测结果显示miR159家族7个前体的最小折叠自由能在-56.54--92.53 kal/mol之间,均能自发形成典型、稳定的茎环二级结构.系统发育进化树显示龙眼miR159家族前体与成熟体成员均具有保守性与多样性.靶基因预测发现龙眼miR159家族所有成员共预测出14个不同靶标,其中3个成员也可以作用于同一靶标.实时荧光定量PCR显示,龙眼pre-MIR159家族成员间在不同组织部位表达量差异显著,但表达趋势却几乎一致,其中花器官中表达量最高,提示了dlo-miR159在生殖器官形成过程中具有重要的作用,尤其是在雄花中作用显著.本研究表明龙眼miR159家族在进化过程中形成了保守性与多样性并存的进化特性,并且可能在花器官形成过程中发挥了重要的作用.     

龙眼BRI1基因家族的全基因组鉴定及光照响应表达

为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能及响应光照机制,对其BRI1基因成员鉴定、基因结构、蛋白保守结构域、启动子顺式作用元件、互作miRNA预测、不同体胚发生阶段和不同组织器官的FPKM值及其响应光照表达模式等进行分析.结果表明:DlBRI1基因家族包含4个成员,分别命名为DlBRI1-1、DlBRI1-2a、DlBRI1-2b和DlBRI1-3.DlBRI1是一种无内含子基因,无内含子基因在转录的过程中不需要经历内含子的剪切步骤,是响应外界因素的一种快速应答基因.龙眼BRI1蛋白家族为植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的一种,其在植物激素信号转导和非生物胁迫中具有重要调控作用.龙眼BRI1四个家族成员启动子均含有大量的光响应元件、激素应答元件、非生物胁迫响应元件,表明龙眼BRI1家族基因可能是连接光信号转导与激素信号转导的重要纽带. DlBRI1-3为miR390e的靶基因. FPKM值分析表明,DlBRI1-1和DlBRI1-3在体胚发生过程和不同组织部位中均呈现高表达,推测DlBRI1-1和DlBRI1-3可能在龙眼整个生长发育过程中起到更为关键的作用.荧光定量PCR结果推测,蓝光信号使得miR390的表达量显著减少,导致靶基因BRI1-3的表达量增加,从而影响油菜素内脂从属基因BZR1、转录因子PIF4,进而影响龙眼功能性代谢产物积累.本研究表明DlBRI1具有功能多样性,可能在龙眼响应光信号、激素信号、非生物胁迫及代谢调控中发挥作用.(图8表3参46)     

文心兰15个miRNAs及其候选靶标的表达特性

为了解miRNAs及其候选靶标在文心兰不同组织部位及假鳞茎受软腐病病原菌侵染中的表达规律,基于文心兰转录组和miRNA数据库进行分析,从中筛选获得15个miRNAs,结合生物信息学法对其候选靶标进行预测和功能注释,并利用实时荧光定量技术检测miRNA及候选靶标在文心兰不同组织部位和假鳞茎受软腐病病原菌侵染的表达情况.结果表明,文心兰miRNA数据库的miRNA reads分析提示15个miRNAs不同成员可能在文心兰正常植株和感病不同阶段中差异表达. psRNATarget靶标预测显示,文心兰15个miRNAs有828个候选靶标,其中67个可能与抗病相关,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白、F-box蛋白基因、锌指蛋白、RGA抗病蛋白等.基于文心兰miRNAs读取次数(Reads)和Unigene候选靶标RPKM值,发现miRNAs及其候选靶标在文心兰正常植株和假鳞茎不同感病时段表达均存在差异.实时荧光定量PCR分析显示,在文心兰不同组织部位中,miR159a、miR167b、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a均在假鳞茎和叶中均大量表达,并与对应候选靶标的表达呈负调控关系,推测它们参与假鳞茎和叶的发育和形态建成.在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎中,miR159a、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a在8 h处理时表达量高,并且与对应的候选靶标在侵染0-8 h表达呈负调控关系,推测上述miRNAs通过负调控候选靶标在中期响应软腐病病原菌侵染过程;而miR167b在处理0h高表达,并且与候选靶标在侵染0-8h表达呈负调控关系,推测其通过下调表达参与软腐病病原菌侵染过程的响应.上述研究表明,文心兰miRNAs通过介导候选靶标的裂解可能广泛参与文心兰不同组织的发育及软腐病病原菌侵染过程的响应.     

龙眼胚性愈伤组织Cu/Zn-SOD分子伴侣基因CCS的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在龙眼体胚发生过程中的表达调控机制,以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR法,克隆了长960 bp含有完整开放阅读框的龙眼DlCCS核酸序列,其编码一个含有319个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号:FJ973472).生物信息学分析显示:该蛋白为亲水的、稳定的、含有跨膜结构域的酸性蛋白质,定位于叶绿体;与毛果杨、葡萄、拟南芥、水稻和锦鸡儿具有较高同源性,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域;预测其通过不同的磷酸化方式,改变酶活性及蛋白构象,参与龙眼体胚中超氧化物代谢以及金属离子转运等生物学过程,在氧化还原过程中发挥作用.利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,结果显示,从松散型胚性愈伤组织(Stage 1)到胚性紧实球形结构阶段(Stage 4),DlCCSmRNA的转录水平较低且波动小;当胚性紧实球形结构进一步发育到子叶形胚阶段(Stage 8),其表达量迅速增加,在成熟胚阶段(Stage 9)达到最高峰,提示DlCCS可能在龙眼体胚的中晚期起主要作用     

苯丙氨酸和茉莉酸甲酯对龙眼胚性悬浮细胞柯里拉京积累的影响

基于龙眼胚性悬浮细胞体系的建立,研究苯丙氨酸(Phe)和茉莉酸甲酯(MeJA)不同添加浓度处理对龙眼胚性悬浮细胞生长和柯里拉京积累的影响.在龙眼细胞培养第6天添加苯丙氨酸和茉莉酸甲酯不同浓度处理,测定龙眼细胞干重、柯里拉京含量、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性,并利用qPCR技术分析柯里拉京合成相关基因DlDFR、DlLAR和DlANR的表达模式.结果显示,适宜浓度的苯丙氨酸和茉莉酸甲酯能促进龙眼胚性悬浮细胞的生长和柯里拉京的积累,最适添加浓度分别为20 mg/L和50μmol/L,与对照组相比,柯里拉京含量分别提高了1.9倍、2.9倍,产量分别提高了4.9倍、6.8倍;苯丙氨酸和茉莉酸甲酯能诱导PAL和PPO活性提高,并可能通过诱导柯里拉京生物合成途径上DlDFR、DlLAR、DlANR基因表达下调,进而调控龙眼胚性悬浮细胞中柯里拉京的合成与积累.本研究表明适宜浓度的苯丙氨酸和茉莉酸甲酯可诱导PAL和PPO活性提高,有效促进龙眼胚性悬浮细胞中柯里拉京含量的积累,结果可为今后龙眼细胞大规模培养工业化生产柯里拉京提供科学依据和理论指导.(图4表1参46)     

龙眼生长素受体基因TIR1的克隆及其与miR393互作关系

为了解龙眼生长素受体基因TIR1的功能,以龙眼胚性愈伤组织为材料,在转录水平上对TIR1(命名为Dl TIR1-3)及其启动子进行克隆和分析,并在转录后水平上研究TIR1与mi R393的相互调控关系.结果表明,Dl TIR1-3 c DNA全长2196 bp,包含ORF 1 716 bp,编码571个氨基酸(Gen Bank登录号:KR558761);生物信息学分析发现,Dl TIR1-3属于不稳定蛋白,不含有信号肽,含有跨膜螺旋结构,具有F-box保守结构域和富含异亮氨酸重复结构,且Dl TIR1-3与碧桃TIR1保持较高的同源性.染色体步移法克隆获得Dl TIR1-3启动子序列2909 bp(Gen Bank登录号:KR558763),该启动子不存在Cp G岛但含有大量光反应、激素应答、组织特异性调控、胁迫响应以及其他生长发育相关的作用元件.ps RNAtarget结合改良RLM-RACE验证表明mi R393能够裂解Dl TIR1-3从而抑制其m RNA转录;q PCR结果显示,Dl TIR1-3与mi R393相互平衡能够调节龙眼体胚形态建成及响应激素调控.由此可见,Dl TIR1-3通过转录水平的调控作用在龙眼生长发育、激素应答、组织分化及胁迫响应等过程中发挥重要功能,而在转录后水平上mi R393通过裂解Dl TIR1-3参与相关调控过程.     

龙眼Hsf基因家族全基因组鉴定及体胚发生过程中的表达分析

基于龙眼基因组数据库对龙眼Hsf(DlHsf)基因家族进行全基因组鉴定,并对其基因结构、启动子作用元件和CpG岛分布情况、编码蛋白的理化性质和进化情况以及它们在不同体胚发生阶段和不同组织器官的表达情况进行研究,同时对靶定DlHsf的miRNA进行预测分析.结果表明:DlHsf基因家族共20个成员,基因结构高度保守.它们编码的蛋白具有典型的DNA结合域(DBD),且均为不含信号肽的不稳定蛋白.启动子分析发现,该基因家族成员的启动子除典型的热激元件(HSE)外,还含有MYB元件等与逆境胁迫及生长发育相关的元件,DlHsfA1d、DlHsfA9a、DlHsfA9b和DlHsfC1启动子存在典型的CpG岛.进化树分析表明DlHsf可分为DlHsfA、DlHsfB和DlHsfC三类. qRT-PCR结果表明,DlHsf在胚性阶段(EC)和球形胚阶段(GE)表达量较高,在不完全胚性紧实结构阶段(ICpEC)表达量较低,在龙眼体胚发育过程中呈现"V"状趋势,表明DlHsf可能主要在EC、GE阶段发挥作用.此外,DlHsf家族成员在花芽和花蕾中表达量较高,其次是在果肉中,推测DlHsfs可能与龙眼花发育等生长过程相关. psRNA Target预测结果表明DlHsf基因家族受到miRNA调控,且调控方式多样.本研究表明DlHsf功能多样,可能在龙眼生长发育、胁迫响应、DNA甲基化、组织器官特异表达等生物学过程中发挥作用.(图8表5参38)     

龙眼胚性愈伤组织维生素C过氧化物酶基因(apx)及NADH脱氢酶基因(nad2)部分序列的克隆

采用PCR技术从龙眼胚性愈伤组织中扩增出维生素C过氧化物酶基因 (apx)的部分cDNA序列longan1及NADH脱氢酶基因(nad2)的部分cDNA序列longan31,其中longan31是首次从体胚中克隆到的NADH脱氢酶基因(nad2).杂交结果显示,longan1与胚性愈伤组织和球形胚的RNA具有明显杂交信号,说明longan1在胚性愈伤组织和球形胚阶段特异表达. 图 3参 19     

龙眼Aquaporin家族的全基因组鉴定及其在体细胞胚发生早期的表达

水孔蛋白(AQP)是生物调控水跨膜运输的重要通道.为了解龙眼AQP基因家族的生物学功能,利用本实验室的龙眼基因组数据库,结合生物信息学的分析方法进行龙眼全基因组范围内AQP家族成员的鉴定,并对其蛋白质理化性质、系统进化关系、共线性、选择压力、基因结构、保守基序、蛋白质保守结构域、顺式作用元件、蛋白质互作和体细胞胚早期不同阶段的基因表达情况进行分析.结果显示,龙眼AQP基因家族共有35个成员,蛋白分子量在17.77×10~3-44.30×10~3 kD之间,分布在14条染色体上;经系统发育树分析,可将其分为5个不同亚家族:PIPs、TIPs、NIPs、SIPs和XIPs;不同亚家族间等电点、磷酸化位点、内含子数量和motif分布差异较大;AQP家族成员间共有6对共线性基因,与拟南芥基因组间有28对共线性基因,且在进化过程中都受纯化选择作用;龙眼AQP家族蛋白质都含有MIP保守结构域;其家族成员可与SYP、PP2A和BOR发生互作,PIP亚家族内的蛋白互作关系最强;基因组的FPKM值分析发现,大部分AQP成员可在龙眼胚胎早期不同阶段进行表达,其中DlTIP4的表达量在所有阶段远高于其他成员,可能在整个过程中发挥着重要作用.本研究表明龙眼35个AQP家族成员基因可能在体细胞胚胎发育阶段发挥重要作用,并且可能响应干旱、低温等非生物胁迫和脱落酸、生长素等植物激素的调控,在功能上具有明显的多样性.(图9表3参55)     

高浓度氯化镍胁迫下酿酒酵母组蛋白H4K5去乙酰化调控金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白(MTs)具有重金属解毒功能.组蛋白乙酰化/去乙酰化是表观遗传因子之一,并且参与基因的表达调控.然而,组蛋白乙酰化/去乙酰化在真核生物响应氯化镍胁迫过程中对金属硫蛋白基因的调控作用还不清楚.以酿酒酵母突变株H4K5R(该菌株模拟组蛋白H4赖氨酸5去乙酰化的状态)为试验材料,采用流式细胞术检测不同浓度氯化镍处理下酵母细胞的死亡率,发现突变菌株的生长状态和细胞存活率明显优于野生型菌株BY4741;qRT-PCR检测5 mmol/L氯化镍处理后,酿酒酵母金属硫蛋白基因Cup1、Crs5、Sod1及转录因子Cup2的表达量.结果显示,高浓度氯化镍胁迫下,野生型菌株中基因的表达水平均显著降低;耐镍菌株H4K5R中,金属硫蛋白基因Cup1表达量上调7.4倍,Crs5表达量显著下调2.56倍,Sod1表达量不显著上调,转录因子Cup2表达量上调3.81倍,并且表达水平均显著高于镍处理后的BY4741.本研究表明突变菌株H4K5R具有较强的镍耐受性;镍胁迫下,突变菌株中金属硫蛋白Cup1与转录因子Cup2的表达变化趋势与BY4741相反,说明组蛋白H4K5的去乙酰化可能通过改变基因表达模式,从而在酿酒酵母响应镍胁迫时发挥重要的调控作用.(图6表1参38)     

铁观音茶树体胚发生及其内源激素变化

以乌龙茶品种铁观音茶树的未成熟胚为供试材料,建立高效的茶树体胚发生再生体系,同时采用高效液相色谱法(HPLC)分析茶树体胚发生过程中各个不同发育阶段的内源激素含量变化趋势.结果显示,诱导茶树体胚发生的培养基为改良MS培养基+2 mg/L苄基腺嘌呤(BA)+0.2 mg/L吲哚丁酸(IBA)+800 mg/L甜菜碱,体胚增殖系统维持途径的培养基为改良MS培养基+3 mg/L肉桂酸+20 g/L蔗糖+10 g/L山梨醇.当3%蔗糖与2%山梨醇组合使用时,子叶形胚的诱导率明显提高.将诱导产生的子叶形胚转接至添加5%蔗糖与5%聚二乙醇(PEG)的无激素MS培养基中,经过40 d左右培养,体胚能正常成熟.成熟体胚接种在附加2 mg/L BA与0.1 mg/L IBA的MS培养基上可以萌发成苗.在体胚发生早期,玉米素(ZT)和赤霉酸(GA3)含量均是先下降,在子叶形胚时期降至最低值,到体胎发育后期的成熟胚与萌发阶段呈明显上升趋势;脱落酸(ABA)含量由球形胚到子叶形胚阶段一直呈现下降趋势,到成熟胚阶段时,出现一个明显的峰值;球形胚中的吲哚乙酸(IAA)含量显著高于其他阶段,之后迅速降低,波动变化.ABA/IAA的比值先增大,然后减小;ABA/GA3的比值体胚发育前期维持在较高水平,到成熟萌发阶段下降;球形胚阶段IAA/ZT的比值高于其他各个阶段.本研究表明茶树不同发育阶段胚胎的体胚诱导率不同,与生理状态及其内源激素动态变化有关;同时茶树中内源激素含量和比例在体细胞胚胎发育过程中有显著的变化,这种变化在不同胚胎发育阶段起着特定的调节作用.     

不同浓度赤霉素和脱落酸对顽拗性三七种子后熟种胚发育和内源激素的影响

为研究外源激素赤霉素(GA_3)和脱落酸(ABA)对顽拗性三七种子后熟休眠和萌发的作用机理,用不同浓度的GA_3和ABA处理三七种子,观察处理后种子后熟过程的种胚发育,并测定6种与调控种子发育相关的内源激素含量.结果显示:三七种胚和胚乳长度的百分比(即胚率)随着后熟期延长逐渐增加,外源激素GA_3 500mg/L的处理显著提高种子的萌发率;ABA 10 mg/L的浓度处理则明显抑制种子的萌发.经外源激素ABA和GA_3处理后,三七种子内源激素ABA、GA_3含量在后熟初始期显著高于对照组,分别为2.83 ng/g和27.85 ng/g,随着后熟时间的延长逐渐降低;吲哚乙酸(IAA)含量也随后熟时间的推移逐渐降低,但与对照组无显著差异;水杨酸(SA)在三七后熟过程中含量基本保持不变;茉莉酸甲酯(JA)在对照组和ABA处理组中表现为逐渐升高的趋势,并在后熟50 d时达到最大值(1.25 ng/g),而在GA_3处理组中表现为先升高后降低的趋势;反式玉米素(tZT)含量在对照组中基本保持不变,在GA_3处理组中随后熟的延长逐渐升高,而在ABA处理组中则逐渐降低.上述结果表明,外源激素处理可有效调控三七种子内源激素,从而间接调控三七种子的后熟休眠与萌发;其中,高浓度的GA_3处理可以促进种子萌发、缩短后熟期,低浓度的ABA处理则显著延长顽拗性三七种子休眠期.(图6表1参43)     

拟南芥新基因SI(stress insensitive)参与非生物胁迫应答（英文）

非生物胁迫是影响农作物产量的主要因素,植物对非生物胁迫的应答机制一直是植物学研究的热点之一.在拟南芥中克隆和鉴定了一个参与非生物胁应答的新基因SI(stress insensitive),该基因编码一个未知功能结构域的蛋白DUF1336,该家族蛋白结构域具有许多未知功能的假设植物蛋白C末端(约250个残基).在单子叶植物和双子叶植物中,SI蛋白质是保守的.通过瞬时转化实验证明,该蛋白定位于细胞质膜.实时定量PCR分析结果显示,SI基因在各种组织中组成型表达.在花、果荚和种子中表达量相对较高.非生物胁迫和脱落酸(ABA)可以增加SI基因的表达,SI基因在ABA、Na Cl和冷处理后分别上调3.5倍、2.1倍和4.7倍.SI基因的T-DNA插入突变体(SALK_021811C)植株表现出对冷胁迫和高盐胁迫的抗性.种子的萌发实验也表明,突变体种子可以在高盐胁迫条件下萌发,对ABA的抑制作用也不敏感.本研究表明SI基因是植物抗逆性的负调控因子,可为提高农作物的遗传改良提供新的候选基因.     

香蕉MaMPK1基因的克隆与表达模式

为研究香蕉MAPK1的序列特征及其在不同激素处理、逆境胁迫下的表达趋势,以‘天宝蕉’为材料,采用RTPCR技术克隆MaMPK1并对其进行生物信息学分析和不同处理下的表达模式分析.结果显示该基因编码区长为1182bp,可编码393个氨基酸.其编码蛋白具有STKc_TEY_MAPK结构域,属于MAPK基因家族TEY亚型A亚家族,是不稳定的脂溶性亲水酸性蛋白,无信号肽和跨膜结构,有多个磷酸化位点.亚细胞定位预测结果显示MaMPK1主要定位于细胞核.蛋白互作预测结果显示该蛋白与HSFA4A存在互作,暗示其可能在香蕉抗热反应过程中发挥作用.启动子顺式作用元件预测结果显示MaMPK1启动子包含多种激素和逆境胁迫相关作用元件.定量分析结果显示MaMPK1的表达受SA、45℃、低温和盐胁迫抑制,受茉莉酸甲酯(MeJA)和枯萎病菌侵染诱导上调,在脱落酸(ABA)处理后期极显著上调表达.本研究表明MaMPK1广泛参与香蕉逆境胁迫应答.(图9表1参35)