龙眼胚性愈伤组织Cu/Zn-SOD分子伴侣基因CCS的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在龙眼体胚发生过程中的表达调控机制,以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR法,克隆了长960 bp含有完整开放阅读框的龙眼DlCCS核酸序列,其编码一个含有319个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号:FJ973472).生物信息学分析显示:该蛋白为亲水的、稳定的、含有跨膜结构域的酸性蛋白质,定位于叶绿体;与毛果杨、葡萄、拟南芥、水稻和锦鸡儿具有较高同源性,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域;预测其通过不同的磷酸化方式,改变酶活性及蛋白构象,参与龙眼体胚中超氧化物代谢以及金属离子转运等生物学过程,在氧化还原过程中发挥作用.利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,结果显示,从松散型胚性愈伤组织(Stage 1)到胚性紧实球形结构阶段(Stage 4),DlCCSmRNA的转录水平较低且波动小;当胚性紧实球形结构进一步发育到子叶形胚阶段(Stage 8),其表达量迅速增加,在成熟胚阶段(Stage 9)达到最高峰,提示DlCCS可能在龙眼体胚的中晚期起主要作用     

野生蕉miR395a前体克隆与进化特性及启动子分析

植物miR395参与硫代谢调控,并在应答逆境胁迫等方面起重要调控作用.为了解香蕉miR395的分子特性和进化规律,在参考香蕉基因组信息的基础上,结合RT-PCR技术,从三明野生蕉(Musa itinerans)叶片中获得81 nt miR395a前体序列,包含21 nt miR395a成熟体序列.进化特性分析表明,植物miR395a前体存在于27个物种中,野生蕉pre-miR395a序列与双子叶耧斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)最为接近,与单子叶的水稻、玉米、高粱最远,表明野生蕉pre-miR395a的起源比较特殊;前体序列长度差异较大(57-226 nt);miR395a成熟体序列分析发现,来自5p臂上的miR395a序列特异性较大.野生蕉miR395a前体能形成典型的发卡结构,miR395a成熟体位于前体的3p臂上.转录起始位点分析表明,野生蕉pri-miR395a转录起始区域位于-87 bp--38 bp,A为转录起始位点.启动子顺式作用元件预测分析表明,野生蕉miR395a启动子包含多个激素、胁迫、生物钟及光响应元件,可能与响应胁迫密切相关.qPCR检测结果也发现miR395a的表达量在低温胁迫下极显著下调,表明响应低温胁迫.综上表明三明野生蕉在响应低温胁迫过程中miR395a起着重要调控作用,这对于进一步研究野生蕉miR395a在低温胁迫中的作用机制具有参考价值.     

基于多花黄精转录组的HIPPs/HPPs基因家族鉴定与表达调控

PcHIPPs/PcHPPs是一类细胞内可溶性金属结合蛋白,在调节植物重金属稳态、解毒机制、重金属耐受等方面发挥重要作用,目前关于HIPPs/HPPs基因家族在多花黄精中还未有人研究.基于多花黄精不同转录组数据,采用生物信息学进行理化性质分析、亚细胞定位和保守基序及系统进化树分析,并对其功能进行初步分析,研究HIPPs/HPPs基因在不同铅处理下的表达情况.结果表明：从多花黄精中鉴定出68个PcHIPPs和43个PcHPPs基因;PcHIPPs基因家族的氨基酸数为134-501,分子量介于15.53-53.09 ku之间,等电点介于5.12-9.88;PcHPPs基因的氨基酸数为101-352,分子量介于11.46-38.23 ku,等电点介于5.58-10.41;亚细胞定位预测表明,PcHIPPs/PcHPPs基因有73个分布在细胞核内;通过KEGG分析发现PcHPP3、PcHIPP28-5、PcHIPP28-6、PcHPP1-5参与到代谢过程;PcHIPPs/PcHPPs基因在多花黄精根状茎中主要发挥作用,在盐胁迫处理48 h下大部分PcHIPPs/PcHPPs基因表现出明显的下调...     

龙眼miR167家族分子特性及其潜在靶标在体胚发生早期的表达模式

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR167家族在体胚发生早期的转录水平.结果显示,龙眼miR167前体序列存在一个长为20 nt的重叠区域,miR167b的中间序列区域和3’端与此区域存在多个碱基差异;龙眼miR167前体成员均能形成茎环结构,且最小折叠自由能介于-79.95--46.90 Kal/mol之间;分子进化树显示龙眼miR167前体成员分别与番木瓜(Carica papaya)、番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)和大豆(Glycine max)亲缘关系最近,miR167a、c、d、f在成熟体进化树中聚于同一支,靶标预测结果显示它们可能调控6个相同的靶基因,即E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)、AIRP2,MYB转录因子和生长素应答因子(ARF6、ARF8、ARF6-3),miR167b则单独分布于另一支中,并可能调控2个特异靶标,即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)和细胞周期素(cyclin-C1-2-like);qPCR结果显示dlo-miR167a、c、d的表达均呈上调趋势,dlo-miR167d、f在3个阶段的表达水平较低;FPKM值显示ARF6/8、BB在体胚发生早期的表达模式与dlo-miR167a、c、d趋于一致,与AIRP2呈负相关.本研究表明在体胚发生早期ARF6/8和BB可能不受龙眼miR167的靶向调控,miR167可能通过靶向AIRP2参与早期体胚发生的形态建成,提示龙眼miR167基因功能的协同性和独立性并存.(图9表3参54)     

龙眼漆酶家族成员全基因组结构与功能分析

为了解龙眼漆酶(DlLAC)家族的生物学功能,采用生物信息学分析方法进行龙眼基因组LAC基因成员鉴定,蛋白结构域及特性、启动子顺式作用元件、分子进化树分析、体胚发生过程和组织器官特异表达的FPKM分析以及可能互作的mi RNA预测.结果显示:DlLAC家族基因包含42个基因成员,分为7大类;基因家族成员内含子数量1-8个不等,以5个为主,其中DlLAC15-1中存在600 bp短串联重复序列;DlLAC蛋白结构域共存在5种类型,均属于铜蓝蛋白,以3个铜蓝氧化酶结构域为主;DlLAC蛋白均为分泌型蛋白,亚细胞定位预测在胞外,包含2个以上糖基化位点,具有多个保守的motif;5端调控序列预测分析,DlLAC可能具有多个转录起始位点;DlLACp启动子序列均包含大量非生物胁迫应激响应元件、胚乳特异表达元件及MYB结合位点,推测MYB可能通过DlLAC进而调控龙眼胚胎发育.DlLAC9-1p、DlLAC12p、DlLAC17-2p含黄酮类化合物合成调控的MYB结合位点,可能参与龙眼生长发育过程中种子成熟和果皮成色的色素合成途径;DlLAC家族成员可能参与不同体胚发育过程和不同组织器官形态建成.42个龙眼漆酶成员共有28个受miRNA调控,13个成员受miR397调控,可能与木质素合成相关,8个成员受miR1535调控.非miR397调控的成员可能发挥其他重要的生物学功能.本研究表明,DlLAC家族成员在龙眼生长发育过程中除了参与木质素合成以外,还可能参与胚胎发育、胚乳发育、色素合成、组织器官特异表达等重要生物学功能,表现其功能上的多样性.     

文心兰‘南茜’谷氧还蛋白基因克隆定位及表达

为研究文心兰谷氧还蛋白超家族基因ROXY在花药发育中的功能,以文心兰‘南茜’(Oncidium Gower Ramsey)为试验材料,从‘南茜’的转录组网站选取一条与拟南芥At ROXY1/2相似度最高的基因序列(命名为OnROXY1),以该序列的cDNA为模版设计引物,用RT-PCR从‘南茜’花器官中扩增该基因,并对扩增产物进行测序和保守结构域分析.结果表明,OnROXY1基因编码区402 bp,编码133个氨基酸,与‘南茜’转录组网站中的预测序列只有一个碱基差异,但与该预测序列的氨基酸序列和保守结构域完全一致(GenBank登录号:MF696154).OnROXY1基因具有典型的谷氧还蛋白(Glutaredoxin,GRX)基因家族的结构域和CMCC活性位点,因此该基因属于GRX基因家族,并且属于亚类CC型的GRX基因.进化树分析表明,OnROXY1与水稻的Os ROXY1、Os ROXY2和拟南芥的At ROXY1、At ROXY2蛋白序列的一致性最高,进化距离最近.亚细胞定位结果显示,OnROXY1主要定位于细胞核中,少量定位在细胞质中.RT-PCR检测发现,在不同组织部位中,OnROXY1在假鳞茎中的表达量最高,唇瓣中的表达量最低;不同花期的定量结果显示,OnROXY1在脱落干枯期时的表达量最高,盛开期时的表达量最低.本研究推测谷氧还蛋白基因OnROXY1可能在文心兰假鳞茎与根的发育、消除植物体内过多的活性氧以及延缓文心兰花器官的衰老等方面具有重要作用.     

CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑技术研究进展

植物在生长与发育过程中,常遭遇物理、化学或生物性逆境,运用基因编辑技术(Genome editing)有机会了解并克服这些威胁.串联间隔短回文重复序列CRISPR/Cas(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)是近几年来新发现的一种基因定点编辑技术,不仅在基因组解析上是阐明基因功能的重要工具,在植物育种上更为划时代的重大突破.CRISPR系统与细菌抵御外源遗传物质入侵的免疫系统有关,目前,应用最多的是Ⅱ型的CRISPR/Cas9,只需核酸酶Cas9和成熟的crRNA:tracrRNA(CRISPR-derived RNA:trans-activating RNA)复合体就可对特定外源DNA序列进行剪切,该技术已经在拟南芥、烟草、大豆、番茄、马铃薯、水稻、小麦、玉米、高粱、矮牵牛、香蕉、甜橙、苹果、毛白杨及地钱等植物中实现了成功编辑,证明了此基因编辑技术的可行性,并达到植物抗逆境、延缓果实成熟、增加杀草剂耐受性、抗病等效果.Cas9和gRNA的启动子与gRNA的靶标数目对基因编辑效率有所影响,值得进一步深入研究.