荧光假单胞菌高效广谱载体的构建及分析

为促进高GC含量基因在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表达效果更加理想、操作更加简便,本研究首先采用不依赖基因序列和连接反应的克隆(Sequence and ligation independent cloning,SLIC)方法将载体pCIBhis上与复制相关的序列和标记基因片段构建成克隆载体pCIBS1.然后优化荧光假单胞菌转化方法,用电转化法将pCIBS1导入荧光假单胞菌BL915中,随后又将T7和tac基因启动子分别插入pCIBS1中,成功构建了表达载体pCIBS3和pCIBS2.研究发现载体pCIBS1在大肠杆菌和荧光假单胞菌中均较为稳定,并且将绿色荧光蛋白基因插入表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,验证了表达载体功能.本研究构建的表达载体和建立的荧光假单胞菌BL915电转化方法,为高GC含量基因在荧光假单胞菌中的表达奠定了基础.     

假单胞菌表达载体pYMB03的构建与性能分析

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是具有强抗逆性能的环境优势菌,构建其质粒表达载体有着明显的应用潜力.将恶臭假单胞菌AB92019菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基因的启动子PoprL和质粒载体pTrcHis-B的多克隆位点片段插入到质粒载体pUCPl8的EcoRL/HInIII位点,获得了重组载体pYMB03.用绿色荧光基因gfp作为标记进行外源蛋白表达的结果表明,该载体能分别在恶臭假单胞菌AB92019菌株和大肠杆菌DH5a菌株中,由启动子PoprL启动组成型表达GFP蛋白并使细胞产生可见荧光.经SDS-PAGE验证,所产生的GFP蛋白分别占细胞总蛋白的12.5%和5.O%.重组菌株YMB001中GFP表达量与菌体培养时间有关,在稳定期后期其相对荧光强度达到最大值(D600nm=l.0),但与培养温度未见相父性.对携带该载体的2株重组恶臭假单胞菌7次168 h继代培养测定,载体pYMB03的稳定性均为100%.     

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)工程菌株田间残留和扩散的追踪检测

分别在北京和江苏省连云港市对携带Btcry基因的荧光假单胞菌工程菌进行了田间残留与扩散的追踪检测 .对越冬前后的试验地和保护地土壤样品进行抗生素抗性平板分离 ,能检测到极少量的具有与出发菌株相同抗性的荧光假单胞菌菌落 ,但没有发现工程菌株的残留与扩散 .对江苏试验地样品还进行了工程菌株质粒卡那霉素和壮观霉素抗性标记基因的抗性菌落分离 ,绝大多数样品中都能分离到包括荧光假单胞菌在内的抗性菌落 ,土样中菌密度n(cfu) =10 4 ～ 10 5g-1,但进行Btcry基因PCR -RFLP检测时没有从样品中得到特异扩增产物 .研究结果表明 :工程菌株抗性标记基因在自然界广泛存在 ,工程菌在株环境中没有残留和扩散 ,具有良好的生物安全性 .表 4参 8     

不同氮磷比对铜绿微囊藻及附生假单胞菌磷代谢的影响

以铜绿微囊藻及其附生假单胞菌X菌株为研究对象,研究了不同氮磷比对铜绿微囊藻和假单胞菌之间磷代谢的影响.结果发现,无论有无附生菌存在,铜绿微囊藻在氮磷比为16：1时,生长情况最好,此时微囊藻能迅速有效地吸收水中的磷,而且附生菌的存在能促进藻的生长.而在氮磷比为4：1时,藻的生长情况最差,在实验后期,藻细胞死亡分解后把一些含磷化合物释放到了水中,附生菌的存在能够加速藻细胞的衰亡和藻体内磷的释放.     

34株假单胞菌的泛基因组分析

假单胞菌属在各种环境广泛分布且具有重要的生态应用价值,然而当前研究对其环境适应性遗传基础的解析尚不充分.选择33株有效发表且具有全基因组序列以及一株新分离的假单胞菌的全基因组进行泛基因组学分析.结果表明,选择的假单胞菌属菌株泛基因组含有173 271条蛋白序列,共有30 847个同源基因家族,包括1 505个核心基因,基因组呈开放型.通过分析不同基因组的基因组演化特征,发现通过基因水平转移获得的基因占整个基因组的比例为32%-48%,其平均基因岛数量为53个.发现假单胞菌属泛基因组的开发性与其频繁的基因水平转移事件和快速的基因进化有关.进一步分析表明,不同基因组中的功能基因家族按照菌株的环境分布进行聚类,表明对特殊环境的适应决定了假单胞菌的遗传特征.本研究初步揭示了假单胞菌属细菌遗传特征的共性与特性,结果可为解析假单胞菌属环境适应性的遗传基础与功能多样性的演化发生机制提供研究线索.(图8表1参37)     

根际微生物耦合降解系统的构建及其对蒽污染土壤的修复

摘要将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的黄麻土生根际优势菌Tu-1B分别与葸高效降解菌An-2和生物表面活性剂产生菌P7-50进行原生质体电融合，得到两株具有荧光标记的融合子Tu-An和Tu-P．将二融合子接种于植物根际土壤，构建根际微生物耦合降解系统，：在40d时该系统的最大降解率为96％．对根际土壤中的Tu-An融合子进行了检测，结果表明融合子在根际能稳定旺盛生长．图3表4参18     

土壤甲胺磷抗性细菌种群特征脂肪酸生物标记的分析（Characteristics of PLFA Biomarkers for Acephatemet Resistant Bacteria Isolated from the Soils）

应用高浓度甲胺磷培养基,对农药厂排污口土壤微生物进行分离,鉴定出21株细菌,分属13个细菌属.对甲胺磷抗性细菌脂肪酸的分析,共测定到38个脂肪酸生物标记(PLFA),这些生物标记分为4种类型,即1)高频次分布的生物标记,普遍存在于细菌类群,属于细菌总体类群(Bacteriaingeneral)的生物标记;2)中频次分布的生物标记,在细菌种出现概率中等,可以用于代表细菌属类群(Bacteriumgenus)识别生物标记;3)低频次分布的生物标记,在细菌中的分布概率较小,可以用于指示特定细菌种间差异的生物标记;4)微频次分布的生物标记,这种生物标记仅在一种细菌种类出现,是细菌种特征生物标记.利用脂肪酸生物标记分析同属细菌不同种的差异,可将假单胞杆菌属分为2类,第1类包括了铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌,其特征为17:0CYCLO生物标记含量小于3.60%;第2类包含了伞菌假单胞菌、威隆假单胞菌、恶臭假单胞菌、温哥华假单胞菌,其特征为17:0CYCLO生物标记含量大于5.99%.利用脂肪酸生物标记的差异对甲胺磷抗性细菌种的聚类分析,能有效地将细菌类群分为3类,微生物群落中存在着稳定的生物标记和受环境影响的生物标记,论文提供了一种脂肪酸生物标记的分析方法,结合细菌的生物学特性研究,可以解释微生物在环境中的变化,对于土壤微生物群落的研究具有重要意义.     

Tet抗性铜绿假单胞菌接合转移pHN102方法研究

二亲本杂交实验通常要求受体菌不能携带有与质粒上相同的抗性.本次实验中受体菌铜绿假单胞菌(Pseudo-monas aeruginosa)和重组质粒pHN102都带有四环素(Tc)抗性.考虑到质粒pHN102导入受体菌后至少带有两个Tc抗性基因片段,转移接合子的抗性会增强,所以提高四环素浓度至20μg/mL,并利用pHN102上携带的luxAB发光酶基因标记受体菌筛选转移接合子,并设立对照菌株.通过抽提质粒、琼脂糖凝胶电泳检测,确定pHN102成功转入P.aeruginosa中.转移接合子经4次转接后,质粒仍可以稳定存在且能够稳定表达.P.aeruginosa(pHN102)的发光动力学曲线表明,加入底物20min后,发光强度趋于稳定.经液体培养稀释后进行发光度和活菌数测定,发现二者呈显著的线性关系(r=0.994).图4表2参6     

质粒pACYC184电转化松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5－1A

以质粒pACYC184为材料,研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌的最适电转化条件.结果表明,荧光假单胞菌GcM5-1A培养至D600nm为0.5时制备感受态细胞,以300 mmol/L蔗糖溶液为电击缓冲液,质粒DNA终浓度为0.01 ng/μL,在25 μF电容、9 kV/cm电场强度、200 Ω电阻的电击条件下电击一次,可得最大的电转化效率,即5.5×106/μg(DNA).SDS-PAGE分析显示,转化质粒pACYC184的氯霉素抗性基因在受体细胞内得到了表达.本方法的建立为松材线虫携带的荧光假单胞菌的基因导入提供技术支持.为进一步通过基因敲除的方法,选择性地失活特定功能基因,进而确定这些基因在松材线虫病病理进程中的作用奠定基础.图2参16     

石油降解菌株G5 16S rDNA全序列的系统学分析

用PCR方法扩增了一株石油降解菌株G5的16S rRNA基因全序列，并对其进行了克隆和测序．对该序列在GenBank中的BLAST结果表明，所有与该序列高度同源的序列都是假单胞菌的16S rRNA基因．其中假单胞菌的代表菌株Pseudomonas aeruginosa，P．fluoroscens，P .putida，P.syringae的16S rRNA基因序列与G5的16S rRNA基因序列同源性分别为93．4％，98．4％，96．3％，97．5％．对G5和其他39株假单胞菌的16S rRNA基因序列进行聚类分析，获得的系统发育树与RDP(Ribosomal Database Project)报道的系统发育树基本一致，其中菌株G5与5株P．chlororaphis聚类在一起．图2参7     

一株聚丁二酸丁二醇酯降解菌的分离鉴定

以聚丁二酸丁二醇酯（PBS）为唯一碳源,通过滤纸片法对西安郊区土壤中可有效降解PBS聚合物的微生物进行分离,并成功获得一株降解效果最为明显的细菌菌株,其在30 d内可使PBS聚合物的数均分子量降低19.80%。采用生理生化实验以及16S rDNA序列对比分析对该菌株进行了鉴定。结果表明,该菌株的生理生化特征与铜绿假单胞菌属相似,且其16SrDNA序列与Pseudomonas aeruginosa 39016 contig 00492的核苷酸序列同源性达99%,结合生理、生化指标鉴定结果,进一步确定该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudanonas aeruginosa）。该菌株的分离鉴定为进一步研究PBS聚合物的生物降解特性及机理等奠定了基础。     

附生假单胞菌存在下不同光照时间对铜绿微囊藻生长与磷代谢的影响

通过设置8/16、12/12、16/8不同光暗比,分析了附生细菌存在下不同光照时间对铜绿微囊藻(M icrocystis aeruginosa)生长及其与附生假单胞菌(Pseudom onassp.)磷代谢之间关系的影响。结果表明:光照时间越长,铜绿微囊藻生长越快,16 h光照下的比增长速率为8 h光照下的1.6倍。铜绿微囊藻的快速生长促进了附生细菌中磷的释放;藻细胞增殖越快,附生细菌释放的磷越多。铜绿微囊藻对数生长期末,8、12、16 h光照下附生细菌磷含量分别降至对数生长初期的87.8%、78.6%和64.9%。铜绿微囊藻对附生细菌磷释放的促进作用是由藻细胞生长对磷的消耗再吸收导致的。     

一株放线菌对铜绿微囊藻的溶藻活性

从庐山土样中分离得到一株放线菌JXJ 0071,研究了该菌的孢子、菌丝体和代谢产物对铜绿微囊藻(Micro-cystis aeruginosa)的溶藻活性以及溶藻活性成分的稳定性,并对其分类地位进行鉴定。结果表明,放线菌JXJ 0071的孢子和菌丝体均能使铜绿微囊藻细胞密度显著降低。该菌代谢产物对铜绿微囊藻具有很强的溶藻活性,在藻密度为1.0×107 mL-1的藻液中加入体积分数φ为2%的该菌发酵上清液3,d后溶藻效率达98%。溶藻活性成分主要来自水溶性胞外产物,其对高温、pH和紫外线处理均具有较好的稳定性。以60℃以下的温度处理发酵液2h,溶藻活性成分的溶藻效率基本不变,保持在95%以上;pH 7.0～9.0条件下,其溶藻效率仍很高,在93.8%以上;经波长为254 nm的紫外线照射2 h,其溶藻效率仍达85.7%。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该菌株属链霉菌属,与Streptomyces rectiviolaceus的序列相似性达99%,但JXJ0071与S.rectiviolaceus的部分生理生化特性有所不同,需要进一步的实验数据确定其种一级分类学单元。     

全期表达外源基因的重组杆状病毒

构建了含早期、晚期、极晚期启动子、全期表达ＨＢｓＡｇ 基因的重组杆状病毒ｖＴｎＮＰＶＰ３５ＨＢｓＯＣＣ＋ ．结果ＨＢｓＡｇ 表达时间由感染后１２ ｈ 提前到４ ｈ,而其表达量,特别是病毒感染早期的表达水平亦显著提高,其中２４ ｈ 和９６ ｈ 的表达量分别比对照提高１８０ ％ 和６０ ％ ． 转录起始位点分析结果显示,该重组毒株可在病毒感染的早、晚期形成多个转录本     

Ralstonia eutropha菌株镉抗性调节基因CzcR的克隆与序列测定

G-细菌镉抗性决定子是一个编码4个蛋白的CzcCBAD操纵子,参照GenBank已登录Czc基因序列进行引物设计,利用PCR技术,从可在含350mg/LCdCl2的培养基上生长的抗镉菌株Ralstoniaeutropha质粒中,扩增出长度约为1200bp的革兰氏阴性细菌镉抗性系统中的抗性调节基因CzcR,然后将其亚克隆到pGEM-T-easy载体上,并转化至受体菌中,构建重组质粒,采用碱性裂解法提取质粒DNA后,经EcoRI酶切分析和核苷酸序列分析,其与GenBank中登录的CzcR基因序列相似性高达98%,显示其具有正确的CzcR基因核苷酸序列。镉抗性基因的获得将大大推动对微生物抗重金属机理的研究,并为进一步构建耐镉基因工程菌,高效净化重金属污染环境打下坚实的基础。     

邻苯二酚2,3-双加氧酶基因克隆、定位和高效表达

采用特异性引物，以菲、芘降解菌株ZL5的代谢性质粒为模板，扩增出邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O)基因，将该基因和表达载体pET—30a( )连接，转化E.coli JM109(DE3)，获得了高效表达的转化子，SDS—PAGE结果表明，转化子的C23O蛋白不仅在细胞内存在，而且能被分泌到胞外，薄层扫描显示，转化子细胞内和细胞外表达蛋白总量占细胞总蛋白的42％，酶活分析表明，分布在转化子细胞内、外的表达蛋白都具有较高的C23O比活力，Southern杂交将菌株ZL5的C23O基因定位在内生质粒的不同酶切片段上。图5表1参12。     

溶藻放线菌对铜绿微囊藻和小球藻竞争生长的影响

从土壤中分离获得l株对铜绿微囊藻有明显抑制作用的橄榄网状链霉菌SG-001（Streptomyces olivoreticuli SG-001）,研究其对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）和小球藻（Chlorefla pyrenoidosa）竞争生长的影响。结果表明：SG-001菌株的活性物质主要存在于无菌滤液中,能够强烈抑制铜绿微囊藻的生长,但对小球藻的生长具有明显的促进作用。当混藻中两种藻细胞初始接种浓度均为4.0×106 mL-1时,在BG11纯培养条件下,添加SG-001无菌滤液有利于小球藻生长,但对铜绿微囊藻抑制作用不明显;而SG-001无菌滤液对天然加富水样中的铜绿微囊藻具有明显抑制作用,在同时接种有铜绿微囊藻和小球藻的混合藻液中,添加SG-001无菌滤液能够明显提高小球藻的生长竞争能力,且水体中氨氮和可溶性总磷的去除率可分别达到85%和93.33%,而铜绿微囊藻在第8天时生长基本被小球藻抑制。     

一株溶藻细菌对铜绿微囊藻的溶藻机理初探

为确定溶藻细菌S7（Chryseobaterium）对铜绿微囊藻的溶藻方式,分别采用高温灭菌（121~123℃）、离心（10 000 r.min-1）、0.22μm滤膜过滤等方式对S7菌液进行处理,检测其对铜绿微囊藻的去除效果。并通过对溶藻过程中叶绿素a和丙二醛（MDA）含量的测定,藻细胞显微结构的观察和细胞成分的红外光谱分析,初步探讨菌株S7对铜绿微囊藻的作用机理。结果表明,S7是通过释放胞外活性物质间接溶藻,该物质具有很强的热稳定性,不属于蛋白质类物质。该活性物质对铜绿微囊藻的叶绿素a有明显的去除效果,并可导致藻细胞膜脂过氧化产物MDA积累量的显著提高和藻细胞解体。藻细胞红外光谱分析表明,经过溶藻物质作用的藻细胞,其蛋白质结构遭到破坏。通过试验结果,推测出菌株S7的溶藻机理：溶藻物质先损伤铜绿微囊藻的细胞壁和粘质胶被,然后通过改变膜的选择透过性进入藻细胞内部,分解叶绿素a,破坏蛋白质,造成藻体正常生理功能的丧失,最终导致藻细胞破裂。     

长链烷烃降解菌alkB片段的分离和鉴定

分离并鉴定了长链烷烃降解菌Pseudomonasaeruginosa1785和P.marginata766烃羟化酶基因alkB片段.根据烃羟化酶的保守氨基酸序列,设计兼并引物,扩增P.aeruginosa1785和P.marginata766的alkB片段,获得了目标产物.经DNA测序和氨基酸序列分析,证实目标片段编码的肽段含有烃羟化酶的特征基序.由此确认采用该方法分离到了长链烷烃降解基因的alkB同源体片段.DNA序列比对结果表明,P.aeruginosa1785和P.marginata766的alkB片段与P.aeruginosaPAO1的alkB1和alkB2的相似性分别达到95.7%和94.8%.这些alkB片段可用于分析烃降解微生物群落结构.图3表2参11