多环芳烃降解菌ZL5分离鉴定及其降解质粒

通过选择性富集培养，从辽河油田石油污染土壤中分离到一株多环芳烃(PAHs)降解菌ZL5．它能以菲和芘为唯一碳源生长，但是不能利用萘．16S rDNA核苷酸序列分析结果表明，ZL5属于变形细菌α亚类中的鞘氨醇单胞菌属．该菌株含有一个大小约为60kb的质粒．丝裂霉素C消除实验表明，随着质粒的丢失，菌株利用菲和芘的能力也丧失．用电转化和氯化铷转化法分别将菌株ZL5的质粒导人大肠杆菌JM109和DH5α中，随着质粒的获得，这些转化子获得了降解菲和芘的能力．本研究结果表明，鞘氨醇单胞菌ZL5降解PAHs的功能和质粒有关。     

麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性

海藻糖是一种具有很多功能的非还原性二糖,在生物制品和食品等行业中具有较广泛的用途.对来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12海藻糖酶转化过程中的关键酶基因--麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因进行了遗传密码子的人工改造,合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量,然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,筛选出重组载体并将其导入巴斯德酵母(Pichia pastoris)细胞进行重组表达以用于海藻糖的酶转化.最后获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株,分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800U/mg(蛋白质),该重组菌株遗传稳定率达84%以上,为工业化酶法生产海藻糖奠定了一定基础.     

海洋破囊壶菌△~5-延长酶和△~4-脱饱和酶在酿酒酵母中的共表达

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA C22:6n-3)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸.分别以质粒pYTFD5和pYFAD4为模板,扩增获得860 bp的△5-延长酶基因(elo5)和1 600 bp的△4-脱饱和酶基因(fad4).利用重叠延伸PCR构建elo5-fad4融合基因,Hind Ⅲ/Sph Ⅰ双酶切后连接到经同样处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYEL05-FAD4.转化酿酒酵母尿嘧啶缺陷型菌株INVScl,通过缺少尿嘧啶的选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C20:5底物.半乳糖诱导表达.气相色谱-质谱分析表明,重组酵母总脂肪酸中出现了DHA(二十二碳六烯酸,C22:6n-63)新产物,融合基因elo5-fad4在酿酒酵母中得到了表达.图7表1参18     

稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母工程菌初步构建

分别克隆了休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)的木糖还原酶基因XYL1和热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因XYL2,构建出重组表达质粒pACT2-xy11和pDR195-xy12,并使其分别转化酿酒酵母受体细胞.酶活测定结果显示,转化子中木糖还原酶和木糖醇脱氢酶均在宿主菌中得到活性表达.并将这两个基因连同各自重组表达质粒上的表达元件进行了克隆,进而构建出重组酵母染色体整合质粒YIp5.kanR-x12,以期今后通过同源重组的原理将上述基因整合到发酵性能良好的酿酒酵母基因组中,得到稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酵母菌株.图3表1参15     

L-山梨糖还原酶基因在大肠杆菌中的表达及融合蛋白的酶学特性

为获得L 山梨糖还原酶 (SR)整个操纵子序列 ,以 pGEM 3zf( )作为载体构建了Gluconobactersp .S6基因文库 .结合转化子在以L 山梨糖为唯一碳源培养基上的生长情况 ,利用PCR技术筛选到一个含L 山梨糖还原酶基因的阳性克隆pGEM 3zf( ) sr3/E .coli,酶切鉴定插入片断长度约 5 .0kb左右 .以 pGEM 3zf( ) sr3/E .coli质粒DNA为模板 ,扩增SR结构基因 .PCR产物经测序验证为SR基因序列后 ,与表达载体Pet32a( )相连 ,转化宿主大肠杆菌AD4 94 (DE3)对SR基因进行表达 ,并利用重金属离子亲和层析技术对SR融合蛋白进行了纯化 ,对其酶学特性进行了研究 .结果表明 :还原型辅酶II(NADPH)是SR酶蛋白的最适电子供体 ;SR酶蛋白的最适反应pH为 7.0 ,pH为6 .5时保持稳定 ,酶活力较高 ;最适反应温度是 5 0℃ ,30℃时热稳定性较好 .SDS PAGE电泳分析 ,SR融合蛋白的Mr 在6 5× 10 3 左右 ,由此推测出天然SR的Mr 在 5 3× 10 3 左右 ,与SR基因序列推测出的分子量大小一致 .图 13表 2参 6     

检测致畸物的gfp基因工程菌的构建

RecA与UvrA是细胞SOS系统中重要的修复蛋白，在细胞DNA损伤后诱导表达．将报告基因绿色荧光蛋白基因（gfpmut3a）分别置于recA和uvrA启动子调控下，构建成质粒pRecAgfp和pUvrAgfp，并转化E．coli DH5α，构建成检测菌株ERS101和EUS101．试验发现，菌株ERS101和EUS101在致畸物吖啶橙处理后，GFP的表达量增高，菌悬液经507nm的蓝光激发后产生的绿色荧光明显增强，且与吖啶橙的浓度具有一定的相关性，即使在0．5μg mL^-1的吖啶橙诱导下也能检测到荧光增强效应．对硝基酚等多种致畸物处理后的检测菌株均有荧光增强效应．图4表1参9     

汕头海域几丁质酶产生菌的筛选及其几丁质酶编码基因研究

在汕头海域表层沉积物中分离得到69株高产几丁质酶的菌株,对其中6株形态特征差异比较明显、几丁质酶活力比较高的菌株SWCH-1、SWCH-2、SWCH-3、SWCH-5、SWCH-6和SWCH-9进行了16S rDNA序列鉴定,发现它们分别归属于5个属.即短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas).采用兼并引物对6株菌几丁质酶编码基因的催化保守区片段进行了PCR扩增和序列分析,发现菌株均含有18家族几丁质酶编码基因;但是其编码的蛋白序列与NCBI收录的蛋白序列存在着差异,其中菌株SWCH-1和SWCH-3的蛋白序列与数据库中序列的相似性比较低,分别为85%和81%,菌株含有比较新的几丁质酶编码基因,其全基因序列的克隆和酶蛋白的纯化分析尚在进一步研究中.图6参18     

铜绿假单胞菌增强型绿色荧光蛋白标记的研究

根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因设计了上下游引物P1和P2,通过对铜绿假单胞菌菌株X3绿色荧光蛋白标记研究,构建了铜绿假单胞菌标记系统,获得带有EGFP标记的基因工程菌X9,为进行相关的跟踪研究创造了条件.该菌株绿色荧光标记性能稳定.通过转化子基因组DNAPCR和斑点杂交检测,外源EGFP基因存在于转化子染色体上. 图 6参 14     

高浓度氯化镍胁迫下酿酒酵母组蛋白H4K5去乙酰化调控金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白(MTs)具有重金属解毒功能.组蛋白乙酰化/去乙酰化是表观遗传因子之一,并且参与基因的表达调控.然而,组蛋白乙酰化/去乙酰化在真核生物响应氯化镍胁迫过程中对金属硫蛋白基因的调控作用还不清楚.以酿酒酵母突变株H4K5R(该菌株模拟组蛋白H4赖氨酸5去乙酰化的状态)为试验材料,采用流式细胞术检测不同浓度氯化镍处理下酵母细胞的死亡率,发现突变菌株的生长状态和细胞存活率明显优于野生型菌株BY4741;qRT-PCR检测5 mmol/L氯化镍处理后,酿酒酵母金属硫蛋白基因Cup1、Crs5、Sod1及转录因子Cup2的表达量.结果显示,高浓度氯化镍胁迫下,野生型菌株中基因的表达水平均显著降低;耐镍菌株H4K5R中,金属硫蛋白基因Cup1表达量上调7.4倍,Crs5表达量显著下调2.56倍,Sod1表达量不显著上调,转录因子Cup2表达量上调3.81倍,并且表达水平均显著高于镍处理后的BY4741.本研究表明突变菌株H4K5R具有较强的镍耐受性;镍胁迫下,突变菌株中金属硫蛋白Cup1与转录因子Cup2的表达变化趋势与BY4741相反,说明组蛋白H4K5的去乙酰化可能通过改变基因表达模式,从而在酿酒酵母响应镍胁迫时发挥重要的调控作用.(图6表1参38)     

肺炎嗜衣原体主要外膜蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达与鉴定

表达肺炎嗜衣原体（Chlamydia pneumoniae,Cpn）主要外膜蛋白（MOMP）的可变区VD2-VD3区．纯化产物并进行免疫活性分析,为探索重组蛋白在肺炎嗜衣原体血清学诊断中的应用提供资料．应用聚合酶联反应（PCR）技术,从肺炎嗜衣原体标准株AR-39的MOMP上扩增出抗原优势表住VD2-VD3区,将目的片段定向插入pET-30a载体,转化大肠杆菌B121,IPTG诱导表达并以Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物并行western-blot鉴定．成功构建了pET-30a-MOMPVD2-VD3的原核表达系统,表达并纯化出相对分子质量（Mr）为24×10^3Da的重组蛋白．Western-blot证实重组蛋白能与Cpn MOMP多克隆抗体发生特异性反应．肺炎嗜衣原体的MOMPVD2-VD3基因可以在大肠杆菌中得到表达,其表达产物能与相应的抗体结合,为肺炎嗜衣原体诊断候选抗原的研究奠定了基础．图4,参9．     

利用 S-层蛋白CTC在苏云金芽胞杆菌细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示鸡毒霉形体粘附素蛋白PMGA1.2的可行性及其免疫原性,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础.用部分pmga1.2基因(pmga1.2p)代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段,构建了2个融合基因ctc-pmga1.2p和csa-ctc-pmga1.2p(csa表csaAB操纵元,其与S-层蛋白牢固地锚定到细胞表面密切相关);将含融合基因的重组质粒电转化入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中,获得了2个重组菌株BCCG(含ctc-pmga1.2p和携带csaAB操纵元的质粒)和CG(含csa-ctc-pmga1.2p).血凝和血凝抑制试验结果显示,2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组蛋白PMGA1.2P;小鼠免疫学实验证实,2个重组菌株所展示的重组蛋白均具有免疫原性,其中,重组菌株CG的免疫效果优于BCCG.结果表明,苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可被用来研制热稳定性禽用口服疫苗.     

促进氰钴胺素转化为腺苷钴胺素的基因表达与鉴定

辅酶B12作为甘油脱水酶(GDHt)的辅酶参与到Klebsiella pneumoniae代谢甘油生成1,3-丙二醇(1,3-PD)和3-羟基丙酸(3-HP)的途径中.前期研究表明底物甘油可以导致辅酶B12分子中Co—C键的断裂,进而引起GDHt的失活.为进一步研究非活性的维生素B12(CNCbI)转化为具有活性的辅酶B12(AdoCbI)的过程,从K.pneumoniae中克隆得到了ATP:钴(I)胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并成功构建了双启动子表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将表达质粒转化Escherichia coli JM109获得了一株重组菌.利用改进的分析方法,结果表明:1)重组蛋白具有腺苷转移酶的活性;2)重组菌可以很好地将非活性的钴胺素,如维生素B12,转化生成具有活性的辅酶B12.     

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.     

一种新去整合素Adinbitor的表达、序列分析及其对C6神经胶质瘤细胞凋亡的诱导

Adinbitor为一通过基因工程方法获得的来自于中国白眉蝮蛇毒腺的去整合素家族的新成员 .从蝮蛇毒腺中提取总RNA进行RT -PCR扩增 ,获得了 2 19bp的白眉蝮蛇去整合素基因 .cDNA测序及由此推导的氨基酸序列结果显示 ,Adinbitor为含有 73个氨基酸的多肽 ,其中包括 12个半胱氨酸 ,并具有去整合素的特征模序 -RGD .对此去整合素基因进行克隆、转化与诱导后 ,得到了该蛋白的可溶性高效表达 .经组氨酸亲和层析纯化 ,获得了分子量Mr为 9×10 3 的均质融合蛋白 ,并将其命名为adinbitor.序列分析表明 ,adinbitor与已发表于GENBANK上的整合素序列有很高的同源性 ,其中同源性最高的是南韩的saxatilin ,二者的蛋白质同源性高达 91.78% .活性测定结果表明 ,Adinbitor能有效地诱导神经胶质瘤细胞C6的细胞凋亡 ,有希望成为一种抗癌新药 .图 5参 15     

睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因插入失活突变体构建及降解特性分析半

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是革兰氏阴性菌,能够以各种类固醇化合物作为唯一碳源和能源,生物信息学分析发现睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因编码蛋白属于LuxR-type转录调控蛋白.利用同源重组原理构建teiR基因插入失活突变体C. mut,初步研究TteiR基因在类同醇代谢途径中的作用,以及对睾丸酮丛毛单胞菌关键降解酶3a-HSD/CR的表达影响.结果发现,teiR基因插入失活突变体C.mut在LB培养基中的生长速率不受影响,突变体C.mut抑制了teiR基因和关键降解酶3a-HSD/CR的表达,同时突变体C. mut丧失了以睾丸酮作为碳源进行生长的能力.结果表明teiR基因调节睾丸酮丛毛单胞菌类因醇代谢,同时teiR基因表达对3a-HSD/CR基因的表达是必需的.图7参14     

重组人核糖核酸酶抑制因子基因的siRNA表达载体构建及B16细胞中基因沉默的鉴定

人核糖核酸酶抑制因子(Human ribonuclease inhibitor, hRI)是细胞质中的一种酸性糖蛋白,可以与血管生长因子(Angiogenin, Ang)紧密结合从而抑制血管形成.利用全基因组合成法合成针对人核糖核酸酶抑制因子基因(hri)的发夹shRNA序列,亚克隆到siRNA表达载体pKD;重组载体经酶切鉴定后,用脂质体法与报告基因绿色荧光蛋白重组融合的人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri共转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测干扰效果.用Image-Pro plus 4.5软件对绿色荧光照片半定量分析干扰效率.结果表明,荧光显微镜显示B16中表达的绿色荧光被干扰,荧光强度半定量分析干扰效率可达80%以上.成功重组构建了针对hri的siRNA表达载体.图5参9     

矮牵牛花香基因BSMT3的cDNA克隆与表达特征分析

以矮牵牛花瓣总RNA为模板,RT-PCR方法克隆得到其BSMTcDNA,全长1100bp,编码357aa,与已有报道phBSMT1(GenBank No.AA0501)和phBSMT2(AAO45013)的同源性分别达到97.76%和98.6%,该序列在Gen-Bank登录号为DQ494491,命名为phBSMT3.构建的BSMT3 cDNA的原核表达质粒pGBSMT转化BL21(DE3)E.coli,获得的重组菌株经0.01mol/LIPTG诱导后得到正确表达的GST-BSMT融合蛋白带,以纯化的重组表达蛋白免疫家兔获得其兔抗免疫血清.免疫组化研究结果证实,矮牵牛花香基因BSMT在花瓣、花管中的表达量较其它组织的表达量高.图5参24     

纳豆激酶原核表达载体的构建及其活性鉴定

利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得了纳豆激酶成熟肽基因(NK),从而构建了大肠杆菌表达质粒NK/pTWIN1,NK/PET32a及NK/PML-c2x,经分别转化宿主菌ER2566,BL21和ER2566,获得了转纳豆激酶基因重组菌.结果表明,NK/pTWIN1-ER2566和NK/PET32a-BL21的纳豆激酶蛋白表达量较高.本研究选用NK/pTWIN1-ER2566作为表达菌株,对其进行发酵表达.SDS-PAGE显示,目的蛋白约占菌体总蛋白的36%,该蛋白是以包涵体形式存在的.包涵体经收集、蛋白变性及复性,并经过SP Sepharose分离纯化,得到了纯化的纳豆激酶蛋白,琼脂糖-纤维蛋白平板法测出1mg纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于600u尿激酶.本文从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为利用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础.图5表1参11