野生槐耳的分离、鉴定、培养条件及产漆酶能力

以采集自北京香山公园加拿大杨(Populus canadensis)的槐耳子实体为材料,利用组织分离获得纯培养并保存,编号为XS-01.结合形态与ITS鉴定确定其分类地位,进一步开展菌丝最适生长条件和液体发酵产漆酶研究.通过PCR扩增,获得长度为598 bp的部分ITS序列(KY933481),采用MEGA 6.0构建发育树、测定遗传距离,XS-01与槐生多年卧孔菌(Perenniporia robiniophila)相似性最高,为100%,遗传距离为0.000.进一步结合子实体和菌丝形态,确定XS-01为槐生多年卧孔菌.结合生长速度和长势,确定了该菌株的最适生长碳源为淀粉和麦芽糖,最适生长氮源为酵母浸粉,最适生长C/N比为30/1-60/1,最适生长温度为32℃,最适生长pH 7,最适生长因子为VB1.Cu~(2+)诱导的胞外漆酶发酵研究表明,1.0 mmol/L Cu~(2+)对漆酶产量有显著的促进作用,产量在96 h达到最大值,为417.5 U/mL,比对照组提高93.4%,而2.0 mmol/L Cu~(2+)对漆酶产量有显著抑制作用,96 h酶活为79.0 U/mL,是对照组的36.6%.本研究获得具有高产胞外漆酶能力的槐耳菌株,具有潜在的应用开发价值.     

二年残孔菌的培养条件优化及其液体发酵产物的抗氧化及漆酶活性

二年残孔菌(Abortiporus biennis)是一种具有抗氧化、抗肿瘤功效的药用白腐真菌,可降解木质素、造成木材白色腐朽.以分离自江苏无锡的二年残孔菌WX-02菌株为材料,开展菌丝最适培养条件、液体发酵产物抗氧化活性及Cu2+诱导产漆酶活性研究.基于单因子试验的最适生长条件结果表明,葡萄糖是WX-02菌株菌丝体生长的最适碳源,牛肉膏和黄豆粉为最适氮源,C/N比为40/1时长势最佳,玉米粉和VC为最适生长因子,而菌丝生长最适pH和温度分别为7.0和32℃10%(V/V)接种量、28℃、150 r/min培养72 h条件下,PD培养基发酵液的总抗氧化活性为2.76±0.31mmol/L(FeSO4)和0.40±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为100.00%±0.00%,总SOD活力为15.75±0.25 U/mL;最适培养条件液体培养基发酵液的总抗氧化活性为0.20±0.03mmol/L(FeSO4)和0.16±0.01 mmol/L(Trolox),DPPH自由基清除率为59.06%±0.61%,总SOD活力为15.65±0.62 U/mL. 0.25 mmol/L Cu2+对胞外漆酶诱导效果最佳,PD培养基、0.25 mmol/L Cu2+、28℃、150 r/min培养96 h,胞外漆酶活性最高,为(1.82±0.02)×105 U/mL,是对照组的1.72倍.本研究表明WX-02菌株具有良好的抗氧化和产漆酶活性,具有药用和环境治理开发应用潜能.(图4表4参34)     

一种野生香蘑的分离、鉴定、培养条件与产酶特性

为充分开发利用野生食用菌资源,从采集自北京怀柔的野生香蘑子实体中分离获得纯培养,编号为Lepista sp.GSM-11,结合形态学特征与ITS序列分析鉴定其分类学地位,并进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、生长因子、最适温度和最适pH值,并测定了菌体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶、核糖核酸酶和凝集素的特性,同时还研究了Cu2+对漆酶产量的影响.结果表明,该菌株与GenBank中报道的采集自中国辽宁、美国马里兰州和日本宫城的紫丁香蘑(Lepista nuda)同源性最高,分别为100%、99.98%和99.93%,确定该野生香蘑为紫丁香蘑(ITS序列GenBank登录号JQ519375);菌丝体生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为酵母浸膏,最适C/N比为20/1,最适生长因子为维生素C,最适温度为24℃,最适pH为7.0;GSM-11菌株菌丝体和发酵液中均具有漆酶活性,但缺乏其他3种酶和凝集素活性.1.0～2.0 mmol/L的Cu2+对漆酶分泌有显著的促进作用,其活性达到对照组的149.2%～196.4%.     

一种田头菇属真菌新记录种的生物学与产酶特性

田头菇是重要的经济食用菌类型,目前我国报道种仅有10个.为驯化栽培和开发利用新的田头菇属食用菌种质资源,以采集自北京延庆的我国新记录种菌核田头菇(Agrocybe tuberosa)GSM-12菌株为材料,研究了菌丝生长的最适碳源、氮源、C/N比、最适温度、最适pH值等生物学特性,以及菌丝体液体发酵产漆酶、蛋白酶、植酸酶和核糖核酸酶的特性.结果显示,菌丝生长的最适碳源为蔗糖,最适氮源为黄豆粉,最适C/N比为20/1-30/1,最适温度为24℃,最适pH为7.0.产酶特性研究显示,GSM-12菌株具有漆酶、植酸酶和核糖核酸酶活性,菌丝体中酶活较高,分别为(77.28±10.44)U/mg、(61.01±2.71)U/mg和(21.13±0.60)U/mg.本研究表明菌株GSM-12可以利用常规营养元素实现营养生长,同时菌丝体液体发酵具有良好的产酶特性.     

一种野生多孔菌的分离、鉴定、培养条件及抗氧化活性

多孔菌是一类子实体呈孔状且质地为革质至木质的大型担子菌,其中一部分具有较高的药用价值.对一株野生多孔菌子实体进行分离纯化获得纯培养BJ菌株,并对其分类、最适培养条件和液体发酵产物抗氧化活性进行分析.采用形态学和ITS分类学鉴定菌株的分类学地位;通过测定菌株在不同碳源、氮源等培养基中的生长状况,研究菌丝最适培养条件;使用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)法测定菌株发酵液总抗氧化活性;使用总超氧化物歧化酶(T-SOD)法、1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)法测定菌株发酵液菌体的总超氧化物歧化酶活力和自由基清除能力.结果显示:经鉴定BJ菌株为石榴嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia punicata).菌丝体最适培养碳源为葡萄糖、麦芽糖和淀粉,最适氮源为酵母浸粉,最适C/N比为10/1,最适温度为28℃,最适pH为7.0.发酵液总抗氧化活性为0.517 mmol/L(维生素E),菌体的总超氧化物歧化酶活力为770.37 U/g,DPPH自由基清除力的IC_(50)为2.14 mg/mL.本研究从野外获取了一株高抗氧化活性的药用多孔菌资源,可为野生药用真菌的开发利用提供理论依据.     

一株桃树内生真菌Pestalotiopsis vismiae N1培养条件优化与抗氧化、抗菌活性分析

对一株内生真菌韦司梅拟盘多毛孢(Pestalotiopsis vismiae)的培养条件进行探究,在此基础上进一步对其发酵提取物抗氧化、抗菌活性进行分析.通过测定菌丝的生长速度寻找菌丝培养适宜的温度、碳源、氮源和pH,并采用正交试验优化培养条件;通过测定菌株深层发酵液提取物对羟基和DPPH自由基的清除率以分析其抗氧化活性;通过测定菌株深层发酵液提取物对多种病原细菌抑菌圈大小的影响来分析其抗菌活性.结果表明,韦司梅拟盘多毛孢菌丝最适宜培养温度为25℃,在该温度培养条件下菌丝生长最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为酵母提取粉,最佳初始pH为6.5,这3种因素的显著性差异大小顺序为碳源氮源 pH;菌株深层发酵液提取物具有良好的抗氧化活性,其对羟基自由基和DPPH自由基清除率的EC50分别为1.19 mg/mL和0.56 mg/mL;菌株发酵液提取物对铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用;深层发酵液提取物抗氧化和抗菌活性具有一定的稳定性.本研究结果可为深入开发利用该真菌资源提供科学依据.(图12表3参26)     

4种重金属对灵芝漆酶活性及转录表达的影响

漆酶是一种分布广泛的多酚氧化酶,在食品、能源和环保等领域具有重要的应用价值.灵芝作为重要的白腐真菌,可以合成分泌包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶,这些酶的活性会随着菌株、发酵条件等不同而不同.以灵芝荣保1号为材料,利用平板实验分析4种重金属(Pb~(2+)、Cd~(2+)、Cu~(2+)和Fe~(2+))在不同浓度下对灵芝菌丝体生长及氧化带形成的影响,用分光光度法测定重金属发酵液中漆酶的活性,并通过实时定量PCR检测重金属离子胁迫下灵芝漆酶同工酶表达的差异性和特异性.结果表明:低浓度Pb~(2+)和Cu~(2+)促进菌丝体生长和氧化带形成,而Cd~(2+)和Fe~(2+)抑制菌丝生长及氧化带形成;Pb~(2+)、Cd~(2+)、Cu~(2+)和Fe~(2+)分别以终浓度为100、20、100、100 mg/kg时对菌丝生长及氧化带的增强作用较大,培养至第11天、第9天、第7天、第7天时,漆酶活性达到最大值,分别为20.83±0.32、15.89±0.21、30.56±0.42、9.44±0.25 U/L,Cu~(2+)促进了发酵液中漆酶酶活,而Pb~(2+)、Cd~(2+)和Fe~(2+)则抑制漆酶酶活.荧光定量PCR结果显示,4种重金属离子在液体培养条件下对15个灵芝漆酶同工酶的转录表达影响存在差异性,其中5个漆酶基因(Glac4、Glac6、Glac10、Glac11和Glac12)转录表达发生上调.综上,灵芝漆酶对重金属离子作用的不同响应表明其具有较复杂的生理功能及调控机制,结果可为进一步阐明漆酶作用机制提供基础.     

纤维素酶产生菌HS-F9的筛选鉴定和产酶条件优化

为了选育高产纤维素酶菌株,通过刚果红鉴别培养基以及滤纸条崩解实验测定,从牛粪堆肥中筛选到一株产纤维素酶的真菌HS-F9,根据菌株形态特性和18SrRNA基因序列分析,初步鉴定该菌为绿色木霉(Trichoderma viride).利用液体发酵培养产生纤维素酶,研究了碳源、氮源、培养时间、培养温度、培养基起始pH、接种量对菌株HS-F9产酶的影响.结果表明:产EG、CBH和FPA的最适碳源均为CMC-Na;EG和CBH在以蛋白胨为唯一氮源时酶活最高,FPase则在以黄豆粉为唯一氮源时酶活最高;产生EG、CBH和FPA的最适温度分别为30℃、30℃、33℃;最适起始pH为3.0、3.0和4.0;EG和FPase的最适接种量为2%,CBH最适接种量达到了8%;培养时间均以5～6d为宜.在最适条件下培养,该菌株EG、CBH和FPase的酶活分别达到了5275.3U/mL、8502.1U/mL和3619.1U/mL,是未优化前的1.42、1.35和1.32倍.图6表2参23     

混合菌群对偶氮染料的脱色降解研究进展

偶氮染料废水的排放会对水生环境及人类健康造成严重威胁.目前生物法处理偶氮染料的应用与研究居于首位,而混合菌群因具有多种微生物间的协同作用成为当前研究的热点.综述混合菌群的构建及偶氮染料脱色降解的影响因素,并重点阐述偶氮染料降解机理及降解酶系的相关研究.研究发现,混合菌群较单一菌株具有较好的脱色降解性能;其中碳氮源、温度、pH值、染料结构与浓度、溶氧量等因素对降解染料具有重要影响.细菌复合菌群是通过分泌一系列的酶如偶氮还原酶等使其偶氮双键断裂,产生的芳香胺类物质进一步被氧化成CO2和H2O,揭示了偶氮还原酶降解偶氮染料时的两种可能机制,即有无依赖氧化还原介质的偶氮染料降解.真菌复合菌群是通过生化反应来催化偶氮染料降解,阐述了漆酶降解染料的机理,即底物自由基中间体的产生和氧气还原成水.细菌与真菌复合菌群则是通过降解酶系统与生化反应相结合来降解染料.最后提出单一菌株存在着降解不彻底、效果不理想等问题,指出未来应根据废水中偶氮染料的种类、结构特点构建具有特异性、高效性且降解多种偶氮染料的混合菌群,并开展其生物降解的分子机制研究,进而为微生物降解偶氮染料的研发提供参考与理论支撑.(图2表3参96)     

重组大肠杆菌产CotA漆酶的发酵条件优化

CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值.将重组表达载体pET-22b/CotA转入大肠杆菌BL21(DE3),得到工程菌株,采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究诱导表达条件和发酵培养基对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响.结果表明,初始pH 7.5的培养基中,添加0.6 mmol L-1 Cu2+,1 g L-1葡萄糖作碳源、15 g L-1蛋白胨和2 g L-1硫酸铵作氮源,以10%的接种量,37℃、200 r/min,直到菌液的D600 nm值为1.0,加入终浓度为1.0 mmol L-1的IPTG,25℃诱导12 h,漆酶的产量最高.优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1 190 U mL-1,优化后达到3 526 U mL-1,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍.纯化的CotA漆酶最适反应温度为45℃,最适pH值为7.2.CotA漆酶对RBBR的脱色率在90%以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶.图6表3参17     

嗜碱菌A4-10碱性纤维素酶产生条件及性质的初步研究

从４８ 份土壤和天然碱湖样品分离出能产生胞外碱性纤维素酶的嗜碱细菌１３５ 株,其中７ 株菌产酶活力大于３ Ｕ／ｍＬ,菌株Ａ４１０ 经条件试验后酶活力达２１ Ｕ／ｍＬ,该菌产生碱性纤维素酶最适培养温度为３４ ℃,最适碳源为ＣＭＣＮａ,最适氮源为复合蛋白胨和酵母粉,该酶的最适反应温度５５ ℃,最适反应ｐＨ９．０ ．     

嗜碱菌A4—10碱性纤维素酶产生及性质的初步研究

从４８份土壤和天然碱湖榈分离出能产生胞外碱性纤维素酶的嗜碱细菌１３５株,其中７株菌产酶活力大于３Ｕ／ｍＬ,菌株Ａ４－１０经条件试验后酶活力达２１Ｕ／ｍＬ,该菌产生碱性纤维素酶最适培养温度为３４℃,最适碳源为ＣＭＣ－Ｎａ,最适氮源为复合蛋白胨和酵母粉,该酶的最适反应温度５５℃,最适反应ｐＨ９．０。     

耐热毛栓孔菌S0301同核体菌株的快速鉴定及产漆酶能力比较

栓孔菌属(Trametes)真菌菌株漆酶同工酶种类多,产漆酶优势独特,是重要的工业漆酶来源之一.为建立方便快捷的获得同核体菌株的方法,以高产漆酶耐热毛栓孔菌Trametes trogii S0301为研究对象,在利用原生质体再生技术得到再生单菌、通过PCR克隆获得该菌株交配型基因b1、b2位点序列的基础上,设计b1、b2交配型基因特异引物并对各再生菌落中不同交配型基因类型进行识别,结合经典的锁状联合显微镜观察,共从45个性状稳定的再生菌株中获得了19个b1b2型异核体菌株,26个b1型同核体菌株,同核体菌株检出率为57.8%,且PCR鉴定结果和锁状联合观察结果一致.此外,还发现b1型同核体菌株菌丝细、菌落稀疏,有更快的蔓延速度,在不添加漆酶诱导剂Cu2+的固体培养基中表现出更强的产漆酶能力.本研究表明PCR克隆交配型基因的方法适用于同核体菌株的快速鉴定,同时b1型同核体菌株具有产漆酶的优势.     

乙羧氟草醚降解菌Reudomonas sp.YF1的分离、鉴定与降解特性

从生产乙羧氟草醚工厂的污水处理池污泥中分离到一株乙羧氟草醚降解细菌,命名为YF1.根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列系统发育分析,将其鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).接种量为5%时,菌株YF1在含200 mg/L乙羧氟草醚的基础盐液体培养基中降解乙羧氟草醚,7 d后降解率约80%.加大接种量和外加营养碳氮源可以促进乙羧氟草醚的降解.该菌株降解乙羧氟草醚的最适pH为7.0,最适温度为30℃.菌株YF1能利用苯酚、邻苯二酚、对苯二酚、苯甲酸、龙胆酸、对硝基苯酚和邻氯苯酚为底物生长,不能利用3-苯氧基苯甲酸为碳源生长,菌株YF1细胞内邻苯二酚1,2-双加氧酶受到乙羧氟草醚或其代谢产物的诱导.图5表1参25     

一株野生桑黄的分离鉴定与生物学特性

桑黄是我国传统名贵的药用真菌,在分类学上是锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)几种药用真菌的总称.从北京延庆区四海镇黑汉岭采集到一株桑黄子实体,经分离纯化获得纯培养(编号SS).进一步开展其分类鉴定、最适培养条件和液体发酵产物活性研究.根据ITS鉴定,确定SS菌株属于锈革孔菌科针层孔菌属(Phellinus),与苹果木层孔菌(Phellinus tuberculosus)的相似性为95%;结合子实体、菌丝特征和寄主植物类型,确定SS菌株为苹果木层孔菌.SS菌株菌丝体最适培养条件研究表明,其最适碳源为葡萄糖,最适氮源为黄豆粉,最适C/N比为20/1,最适生长因子为维生素C,最适温度为28℃,最适pH为7.0.以马铃薯葡萄糖液体(PD)培养基、10%接种量、28℃、150 r/min培养7 d,发酵液中多糖含量为176.71 mg/L,黄酮含量为0.11 mg/L,抗氧化活性为7.82 mol/L(FeSO_4),未检测到多酚的存在.本研究从野外获取新的桑黄药用资源,其生物学特性结果可为野生药用真菌的人工驯化和开发利用提供理论依据.     

一株嗜酸性产纤维素酶真菌的特性及产酶条件优化

从四川海螺沟原始森林腐土中分离到一株嗜酸性产纤维素酶的真菌X-13,其主要特点是产纤维素酶的最适pH及其纤维素酶最适反应pH均为2.0.在PDA培养基上培养时菌落呈浅黄色至肉桂色,反面呈黄色至棕褐色,产黄色色素;菌丝体透明有隔膜,分生孢子呈球形或近球形.根据菌株的形态特征以及ITS序列同源性和系统发育分析结果,鉴定该菌株为土曲霉(Aspergillus terreus Thom).该菌最佳产酶培养时间为8～10 d;最适产酶温度为30℃,纤维素酶最适反应温度为50℃;最佳碳源、氮源分别为纤维素粉和硫酸铵.通过响应面法对菌株产纤维素酶条件进行优化,使菌株X-13纤维素酶活从1.39 IU/mL提高到2.94 IU/mL,提高了111.5%.     

Streptomyces venezuelae GY1产聚乙烯醇降解酶的培养条件

放线菌StreptomycesvenezuelaeGY1产生的聚乙烯醇(PVA)降解酶是一种诱导酶.以4种不同类型的PVA为唯一碳源时,该菌株单位质量细胞产酶能力比以糖类物质为唯一碳源时提高10倍以上.聚合度和醇解度最高的PVA1799是该菌株产生PVA降解酶的适宜底物,其浓度为1gL-1时,PVA降解酶的产量为120u/g(细胞).培养基中PVA1799浓度由1gL-1上升到5gL-1时,该菌株单位质量细胞产酶能力下降73%,表明PVA1799浓度过高会抑制产酶.GY1菌株产酶的最适温度和pH分别为30℃和7.0.在GY1菌株生长过程中控制以下条件有利于产生PVA降解酶:(1)保持培养体系中较高的溶氧水平;(2)在氮源中补充NO-3;(3)在一定浓度范围内添加MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、BaCl2、ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4等金属盐.Pseudomonassp.产生的PVA降解酶能够作用伯醇或仲醇类化合物,以这些伯醇或仲醇类化合物代替培养基中的PVA,不能诱导GY1菌株产生PVA降解酶;而在培养基中有PVA存在时,再添加0.5gL-1的3戊醇和环己醇能够明显促进PVA降解酶的产生(单位质量细胞产酶能力分别提高了21%和32%).图8表1参10     

产聚乙烯醇降解酶的培养条件

放线菌StreptomycesvenezuelaeGY1产生的聚乙烯醇(PVA)降解酶是一种诱导酶.以4种不同类型的PVA为唯一碳源时,该菌株单位质量细胞产酶能力比以糖类物质为唯一碳源时提高10倍以上.聚合度和醇解度最高的PVA1799是该菌株产生PVA降解酶的适宜底物,其浓度为1gL-1时,PVA降解酶的产量为120u/g(细胞).培养基中PVA1799浓度由1gL-1上升到5gL-1时,该菌株单位质量细胞产酶能力下降73%,表明PVA1799浓度过高会抑制产酶.GY1菌株产酶的最适温度和pH分别为30℃和7.0.在GY1菌株生长过程中控制以下条件有利于产生PVA降解酶:(1)保持培养体系中较高的溶氧水平;(2)在氮源中补充NO-3;(3)在一定浓度范围内添加MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、BaCl2、ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4等金属盐.Pseudomonassp.产生的PVA降解酶能够作用伯醇或仲醇类化合物,以这些伯醇或仲醇类化合物代替培养基中的PVA,不能诱导GY1菌株产生PVA降解酶;而在培养基中有PVA存在时,再添加0.5gL-1的3戊醇和环己醇能够明显促进PVA降解酶的产生(单位质量细胞产酶能力分别提高了21%和32%).图8表1参10     

甲胺磷农药降解菌HS-A32的分离鉴定及降解特性

从长期受有机磷农药污染的土壤中分离到一株降解菌HS-A32,能以甲胺磷作为唯一的碳源和氮源生长.HS-A32菌降解甲胺磷的最适温度为30℃,最适pH值为7.0,甲胺磷的最适降解浓度为1 000 mg/L,降解率达82%.聚酰胺薄层色谱(TLC)可检测到降解产物中有NH4 生成.HS-A32菌能以多种碳、氮源生长,外加可利用的碳源和氮源能促进甲胺磷的降解.通过16S rDNA扩增、测序,运用BLAST检索分析,构建系统进化树.结合生理生化鉴定,初步确定HS-A32为不动杆菌属(Acinetobacter).HS-A32菌还能降解甲基对硫磷等多种有机磷农药.图6表1参14     

一株假芝的分离鉴定与生物学特性

灵芝是我国著名传统药用真菌,假芝属(Amauroderma)真菌作为灵芝科重要属,我国已报道种共有22个.本研究从广州白云山采集到一株野生假芝子实体,经组织分离获得菌丝体纯培养,编号GZ-01菌株.利用形态鉴定和ITS鉴定手段,确定其分类学地位为假芝属,系统命名为A.subrugosum,为中国首次记录种,菌种保藏号ACCC52954.生物学特性研究表明,菌丝生长的最适碳源为甘露醇,最适氮源为酵母浸膏或大豆蛋白胨,最适C/N比为20/1,最适生长因子为维生素B6,最适生长温度为28℃,最适p H值范围为6.0-7.5.本研究获得新的药用真菌资源,其培养条件研究可为进一步开发利用奠定实验基础.