稀有鮈鲫成体神经发生相关基因的分子克隆及序列分析

成体神经发生是脊椎动物中广泛存在的一种生物学特征。成体硬骨鱼类的脑展现出强烈的神经活性以及出色的脑修复能力,这使得硬骨鱼类成为研究成体神经发生和脑修复的一个理想的模型。本文克隆了成体稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)脑组织中神经发生及脑修复相关的hes5、pax6、sox11和prox1基因的部分c DNA序列并进行了序列分析。序列分析结果表明,pax6和sox11基因片段与斑马鱼(Danio rerio)对应的基因片段的同源性最高,分别为97%和94%;hes5基因与鲤鱼(Cyprinus carpio)相对应的基因片段的同源性最高,为92%;prox1基因在物种间的同源性最低。基于稀有鮈鲫和已知物种相应基因的核苷酸序列构建了系统发育树,发现稀有鮈鲫prox1基因与其他硬骨鱼类的亲缘关系最远。本文为进一步开展神经毒性类化学品对水生生物鱼类的成体神经毒性作用机制研究提供了分子生物学基础。     

稀有鮈鲫Ras信号通路相关基因的克隆、序列分析及其组织分布

Ras基因是一类在生物进化过程中较为保守的原癌基因,在多种细胞生命活动中起到细胞增殖、分化和细胞骨架构建等重要作用。本文克隆了稀有鮈鲫Ras信号通路相关的k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因的部分c DNA片段,并分析了其序列。序列分析结果表明,k-ras的氨基酸序列与鲤鱼相对应的氨基酸序列同源性最高,为99%;n-ras、pik3cd、pin1和raf1的氨基酸序列均与斑马鱼相对应的氨基酸序列同源性最高,分别为99%、87%、96%和97%,结果表明稀有鮈鲫与鲤鱼、斑马鱼的亲缘关系较近。组织表达分析表明,k-ras、n-ras、pik3cd、pin1和raf1基因在肝脏、鳃、肾脏、脑和性腺等组织中具有表达差异性。本文为研究环境污染物对鱼类致癌作用机制和安全性评估提供分子生物学基础和科学依据。     

稀有鮈鲫神经发育相关基因的克隆、同源性分析及组织分布

作为重要的本土模式鱼类,稀有鮈鲫神经发育相关的生物学背景几乎空白,导致其在神经毒性评价方面的应用受到限制。本文从稀有鮈鲫脑部克隆得到了神经发育相关的神经生长因子(nerve growth factor;ngf)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor;bdnf)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein;gfap)、髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein;mag)、P0蛋白(myelin protein zero;mpz)、微管蛋白α1(α1-tubulin)和Y染色体性别决定基因10(SRY-box containing gene 10;sox10)等基因的片段,并对其进化树及表达谱进行了分析。序列分析表明,bdnf的核苷酸序列与鲫鱼、鲤鱼的同源性最高,均为98%;gfap、ngf、mag和α1-tubulin与斑马鱼的同源性最高,分别为95%、92%、92%和96%;mpz与黑头软口鲦的同源性最高,为94%;sox10与鳙鱼同源性最高,达97%。表达谱分析结果表明,ngf、bdnf、mag、mpz、α1-tubulin和sox10基因均在脑组织中表达量最高,gfap在脊髓中表达量最高,上述结果为这一模式鱼类在神经发育学和神经毒性效应评价方面的应用奠定了基础。     

不同实验条件下稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率

以中国本土鱼种稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎为实验生物,研究稀有鮈鲫胚胎在正常光照条件下(温度(26±1)℃,自然光照)和光照周期颠倒条件下(温度(26±1)℃,光照周期为12 h(暗):12 h(光))的96 h自然受精率和孵化率,并在放大倍数为40倍的体视显微镜下观察稀有鮈鲫在胚胎发育过程中的形态发育时序及特征。结果表明,在光照周期颠倒和(26±1)℃条件下,9次重复试验的稀有鮈鲫胚胎自然受精率和孵化率平均值分别为92.2%和92.8%,变异系数(CV)分别为5.65%和6.21%,比正常光照和(26±1)℃条件下稀有鮈鲫胚胎的自然受精率和孵化率更高,为鱼类胚胎试验提供更高质量的胚胎。稀有鮈鲫胚胎的形态发育时序及特征满足胚胎试验观察的需求,可在特定的时间点观察特定表征。     

磷酸三(2,3-二氯丙基)酯阻燃剂对稀有鮈鲫的毒性效应

为研究新型阻燃剂磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(TDCPP)的毒性效应,以稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为实验生物,采用半静态实验方法,分别进行96 h和28 d的染毒,研究TDCPP对稀有鮈鲫的急性毒性和慢性毒性效应,并通过对稀有鮈鲫脑组织中与神经纤维的生长、发育、轴突再生等相关基因mRNA表达量的检测,初步探讨了TDCPP的神经毒性作用。结果表明：TDCPP对稀有鮈鲫的96 h-LC₅₀为2.99(2.20～3.38) mg·L^-1,根据化学物质对鱼类毒性分级标准TDCPP属于剧毒性。经0.9、1.5、2.1和2.7 mg·L^-1 TDCPP染毒28 d,与对照组相比,暴露组稀有鮈鲫肝脏及脑组织中SOD和GSH-Px的活性均受到抑制,且随着TDCPP的暴露浓度增加,其抑制作用显著增强;暴露组稀有鮈鲫脑组织中与神经纤维的生长、发育相关的微管蛋白α/β、神经丝NF-M以及关键蛋白GAP-43等基因的mRNA表达量,与对照相比均发生显著下调。可知,TDCPP暴露可以诱发稀有鮈鲫神经毒性作用。     

中国本土鱼类模式生物稀有鮈鲫研究应用的历史与现状

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)是一种中国特有的小型鲤科鱼类,从1990年开始,中国科学院水生生物研究所以培育新的实验鱼为目的,对稀有鮈鲫开展了系列的实验动物化研究,并推动其在各研究领域中的应用。随着我国化学品环境管理制度的建立,稀有鮈鲫已逐渐成为我国化学品测试中最重要的受试鱼类。本文综述了稀有鮈鲫分类地位、分布、形态特征、早期发育、生长、繁殖、遗传、对环境的适应性等方面的生物学特点,分析了稀有鮈鲫作为模式生物的优点,介绍了稀有鮈鲫实验动物标准制定进展。随着实验动物标准化工作的深入以及基因组测序工作的开展,稀有鮈鲫将更广泛地应用于相关的研究和检定,成为一种我国具有代表性的本土模式生物。     

氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性效应

为探明氰戊菊酯对鱼类不同生命阶段的毒性效应,以斑马鱼和稀有鮈鲫为测试生物,评价了氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的急性毒性差异。研究发现,氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的96 h-LC50值分别为0.901(0.664~1.22)和0.636(0.233~1.74)mg·L~(-1)。氰戊菊酯对稀有鮈鲫胚胎孵化有明显的促进作用,染毒48 h后,0.188和0.375 mg·L~(-1)氰戊菊酯对稀有鮈鲫胚胎的孵化率分别为88.9%和100%。氰戊菊酯对斑马鱼仔鱼、幼鱼和成鱼的96 h-LC50值分别为0.00340、0.0183、0.00487 mg·L~(-1),氰戊菊酯对稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼的96 h-LC50值分别为0.0520、0.00277、0.00345 mg·L~(-1)。因此,氰戊菊酯对斑马鱼不同生命阶段的毒性从高到低顺序依次为:仔鱼成鱼幼鱼胚胎,氰戊菊酯对稀有鮈鲫胚胎、仔鱼、幼鱼和成鱼的毒性为幼鱼成鱼仔鱼胚胎。试验结果表明,斑马鱼仔鱼对氰戊菊酯的敏感性高于稀有鮈鲫相应的生命阶段,相对于斑马鱼,稀有鮈鲫胚胎、幼鱼以及成鱼对氰戊菊酯的毒性作用更为敏感,说明氰戊菊酯对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生命阶段的毒性效应差异较大。     

三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性比较

为探明三唑酮对鱼类不同生长阶段的毒性效应,以斑马鱼和稀有鮈鲫为测试生物,检测了三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的急性毒性差异。研究发现,三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎为低毒,其96 h-LC50值分别为21.1(14.4~31.0)和14.2(9.65~20.9)mg·L~(-1);高浓度的三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫胚胎的孵化有明显的抑制作用,染毒96 h后,23.7 mg·L~(-1)三唑酮组斑马鱼胚胎的孵化率为4.17%,22.5 mg·L~(-1)三唑酮组稀有鮈鲫胚胎的孵化率为33.3%。三唑酮对斑马鱼仔鱼、幼鱼和成鱼为低毒,其96 h-LC50值分别为24.8、21.3、13.1 mg·L~(-1),三唑酮对稀有鮈鲫仔鱼、幼鱼和成鱼为中毒,其96 h-LC50值分别为9.96、7.89、6.89 mg·L~(-1)。因此,三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫不同生长阶段的毒性效应排序一致,毒性从高到低顺序依次为:成鱼幼鱼仔鱼。试验结果表明,相对于斑马鱼,稀有鮈鲫对三唑酮的毒性作用更为敏感,三唑酮对稀有鮈鲫不同生长阶段的毒性均高于斑马鱼相应生长阶段的毒性。     

稀有鮈鲫作为鱼类胚胎急性毒性试验受试鱼种的敏感性研究

通过验证稀有鮈鲫在鱼类胚胎急性毒性试验中的敏感性,评价其在鱼类替代试验中的应用潜力,为相关化学品测试国家标准的制定提供依据.选取3,4-二氯苯胺(3,4-DCA)、五水硫酸铜(CSP)、2,3,6-三甲基苯酚(2,3,6-TMP)、二甲基亚砜(DMSO)、七水硫酸锌(ZSH)、三甘醇(TEG)、氯化钠(SC)、十二烷基硫酸钠(SDS)、重铬酸钾(PD)、甲基异噻唑啉酮(MIT)、二苯甲酮(BP)、二氯苯氧氯酚(TCS)、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、三唑酮(T)、多菌灵(C)和N-(4-氯苯基)-N'-(3,4-二氯苯基)脲(三氯卡班,TCC)16种化学品,按照《OECD化学品测试准则No.236鱼类胚胎急性毒性试验》,分别进行稀有鮈鲫胚胎急性毒性试验,将结果与稀有鮈鲫成鱼急性毒性试验结果比较,评价稀有觞鲫在不同生命周期对同一化学品的敏感性差异;同时与已有的或试验所得的斑马鱼胚胎急性毒性试验结果比较,评估稀有绚鲫胚胎与国际标准试验鱼种胚胎间的敏感性差异.稀有鮈鲫胚胎急性毒性试验96 h半数致死浓度(96 h-LC50)值与其成鱼及斑马鱼相比,敏感性类似,毒性值差异均未超过一个数量级.稀有鮈鲫作为一种中国本土的标准试验鱼种,其胚胎生物学特征与斑马鱼类似,其胚胎敏感性不亚于成鱼和其他国际标准鱼种,适宜进行鱼类胚胎急性毒性试验的应用.     

酵母双杂交技术构建稀有鮈鲫不同雌激素受体亚型的重组荧光酵母

目前关于环境雌激素(environmental estrogens,EEs)的效应评估大多数是基于人的雌激素受体(estrogen receptor,ER)的离体检测,缺乏EEs对鱼类ER影响的研究。本研究利用酵母双杂交技术构建模式生物稀有鮈鲫不同ER亚型重组荧光双杂交酵母,用以快速检测EEs的雌激素活性并研究不同ER亚型对17β-雌二醇(E_2)敏感度的差异。采用反转录多聚酶链反应法获取稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2的配体结合域(LBD)序列,构建并鉴别诱饵质粒pGBKT7-ERα-LBD、p GBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD。将诱饵质粒和猎物质粒pGAD424-GRIP1同时转化荧光酵母Y187-Luc,分别构建3株稀有鮈鲫ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母,并考察了E_2、双氢睾酮(DHT)、9-顺维甲酸(9-cis RA)、三碘甲状腺原氨酸(T_3)和孕酮(PG)对荧光素酶的诱导情况。结果显示:ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重组荧光双杂交酵母能够专一性地被E_2诱导产生荧光素酶,并存在显著的剂量-效应关系,半数效应浓度(EC_(50))值分别为1.98×10~(-9)、1.77×10~(-10)、和3.52×10~(-10)mol·L~(-1),对E_2的敏感程度排序为:ERβ1-GRIP1>ERβ2-GRIP1>ERα-GRIP1。研究表明,稀有鮈鲫不同ER亚型对E_2的响应具有差异,3株重组荧光双杂交酵母不仅可以应用于快速识别内分泌干扰物中的类雌激素物质,分析稀有鮈鲫不同ER亚型对EEs的敏感性,解析雌激素污染物对稀有鮈鲫的作用机制,评估鱼类接触EEs的潜在风险,以期为水质保障和污染治理提供重要依据。     

全氟辛烷磺酸盐(PFOS)替代品对4种本土水生生物的生态毒性

本文选择了紫背浮萍、四尾栅藻、蚤状溞和稀有鮈鲫4种本土水生生物,开展了阳离子表面活性剂、织物三防整理剂、C4三防整理剂和C6三防整理剂4种全氟辛烷磺酸盐(PFOS)替代品的安全性评估,为筛选理想PFOS化学替代品提供科学依据。急性毒性结果发现阳离子表面活性剂对4种水生生物均未显示出急性毒性;织物三防整理剂、C4三防整理剂和C6三防整理剂对蚤状溞的LC50值分别为17.97、64.61和85.58 mg·L-1,显示出低的急性毒性。另外,织物三防整理剂对四尾栅藻的半数抑制浓度(EC50)值为88.32 mg·L-1,而对稀有鮈鲫半致死浓度(LC50)值为14.79 mg·L-1,均存在急性毒性。短期生长抑制试验结果发现阳离子表面活性剂、织物三防整理剂、C4三防整理剂和C6三防整理剂对稀有鮈鲫生长抑制最低可见效应浓度(LOEC)值分别为20、1.5、100和50 mg·L-1,表明4种PFOS替代品均显示低慢性毒性。急慢性综合分析可知C4和C6三防整理剂相对较安全,可能成为理想的PFOS替代品。     

饵料对稀有鮈鲫幼鱼和成鱼生长的影响及摄食优化策略研究

在实验室适宜的饲养条件下,进行不同发育阶段的稀有鮈鲫为期30 d的摄食-生长实验,研究3种饵料在投喂量分别为鱼体湿重的3.0%、4.0%和6.0%的3种摄食水平条件下,对稀有鮈鲫幼鱼(初始湿重为(0.0749±0.02)g)和成鱼(初始湿重为(0.2603±0.06)g)的生长影响。结果表明,不同摄食水平组的稀有鮈鲫幼鱼的相对增重率和特定生长率随摄食水平的增加而增加,但饲料转化率呈下降趋势;而稀有鮈鲫成鱼的相对增重率、特定生长率和饲料转化率的变化趋势基本相同。适宜摄食水平随稀有鮈鲫体重的增加而降低,稀有鮈鲫幼鱼和成鱼的适宜饵料分别为O.S.I.微细颗粒和O.S.I.细颗粒,适宜摄食水平分别为6.0%和4.0%。     

四氯丙烯对稀有鮈鲫的急性毒性及安全浓度评价

采用半静态试验方式测试了四氯丙烯对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的急性毒性,试验浓度分别设定为0.25 mg·L~(-1)、0.30mg·L~(-1)、0.36 mg·L~(-1)、0.42 mg·L~(-1)、0.50 mg·L~(-1)和0.60 mg·L~(-1),同时进行空白对照(试验用水)和分散剂对照(体积分数为0.006%的吐温-80水溶液)试验。采用气相色谱法对试验溶液进行浓度分析,实测浓度分别为0.19 mg·L~(-1)、0.25 mg·L~(-1)、0.34 mg·L~(-1)、0.40 mg·L~(-1)、0.51 mg·L~(-1)和0.64 mg·L~(-1),试验结果以实测浓度表示和统计。结果表明:四氯丙烯致稀有鮈鲫无死亡发生(EC0)的最高浓度为0.25 mg·L~(-1),导致稀有鮈鲫100%死亡(EC100)的最低浓度为0.51 mg·L~(-1)。根据实测浓度,用SPSS(17.0)概率单位法求得四氯丙烯对稀有鮈鲫的半数致死浓度96 h-LC50为0.347 mg·L~(-1),95%置信区间为0.328 mg·L~(-1)~0.361 mg·L~(-1)。     

稀有鮈鲫作为水生模式生物的研究及探讨

我国本土水生生物稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus Ye et Fu,1983年)是一种优良的试验用鱼，具备成为模式生物必要条件。本文总结了稀有鮈鲫生物生态学研究情况，分析了稀有鮈鲫在多个应用领域与模式生物斑马鱼、青鳉存在的不足和差距，同时借鉴发达国家推动模式生物的实践经验，提出了针对性建议。     

Isolation and characterization of two actins of the Pacific white shrimp, <Emphasis Type="Italic">Litopenaeus vannamei</Emphasis>

Two actin genes named actinT1 and actinT2 were isolated and sequenced from the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, by screening from a shrimp eyestalk cDNA library. L. vannamei actinT1 cDNA has a 1,128-bp open reading frame encoding for 376 amino acids while L. vannamei actinT2 cDNA has a 1,131-bp open reading frame coding for 377 amino acids. Alignment of the actinT1 and actinT2 cDNA sequences showed that these two actin genes share a sequence identity of 86% at amino acid residues. When compared with actins of several other invertebrate and vertebrate species, the nucleotide sequence of actinT1 is highly homologous (97–100%) with beta-actins, while actinT2 shares 86–95% identity with alpha-actins on the nucleotide level. Phylogenetic analysis and BLAST searches indicated that the ActinT1 protein is identical to crustacean beta-actins, while the ActinT2 protein is highly homologous to crustacean alpha-actins. Constitutive expression of the actinT1 and actinT2 genes were detected by RT-PCR in all adult shrimp organs, including brain, eye-stalk, gill, heart, hemolymph, hepatopancreas, muscle, swimming legs, and stomach, as well as in the shrimp zygote, nauplius, and mysis life stages. These data will facilitate attempts to clone and identify more shrimp genes and constitutive shrimp promoters.     

Transgenic Spartina alterniflora for phytoremediation

Perennial monoculture forming grasses are very important natural remediators of pollutants. Their genetic improvement is an important task because introduction of key transgenes can dramatically improve their remediation potential. Transfer of key genes for mercury phytoremediation into the salt marsh cordgrass (Spartina alterniflora) is reported here. S. alterniflora plays an important role in the salt marsh by cycling of␣elements, both nutrients and pollutants, protects the coastline from erosion, is a keystone species in the␣salt marsh supporting a large food web, which in turn supports a significant segment of economy, including tourism, has an impact on cloud formation and consequently on global weather, and is thus an ecologically important species relevant for our life-support systems. Embryogenic callus of S. alterniflora was co-inoculated with a pair of Agrobacterium strains LBA4404 carrying the organomercurial lyase (merB) and mercuric reductase (merA) genes, respectively, in order to co-introduce both the merA and the merB genes. Seven stable geneticin resistant lines were recovered. The presence of merA and merB genes was verified by PCR and Southern blotting. All but one transgenic lines contained both the merA and the merB sequences proving that co-introduction into Spartina of two genes from separate Agrobacterium strains is feasible and frequent, although the overall frequency of transformation is low. Northern blotting showed differences in relative expression of the two transgenes among individual transformants. The steady-state RNA levels appeared to correlate with the phenotype. Line #7 showed the highest resistance to HgCl₂ (up to 500 μM), whereas line #3 was the most resistant to phenylmercuric acetate (PMA). Wild-type (WT) callus is sensitive to PMA at 50 μM and to HgCl₂ at 225 μM.     

PFOS潜在替代品全氟丁基磺酸钾对不同营养水平水生生物的毒性

全氟丁基磺酸钾(PFBSK)作为全氟辛基磺酸(PFOS)潜在的替代品,极易溶于水,主要存在于水体中,因而其水生毒性的研究十分重要。采用OECD 201、OECD 202、OECD 203和OECD 211标准试验方法,研究了PFBSK对羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapitata)、大型溞(Daphnia magna)和中国本土鱼种稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的急性毒性效应以及对大型溞繁殖的影响。组合多终点急慢性水生生物毒性结果：PFBSK的急性毒性终点均大于100 mg·L^-1,大型溞繁殖试验的无观察效应浓度(NOEC)为571 mg·L^-1,最低可观察效应浓度(LOEC)为981 mg·L^-1。按GHS分类导则,PFBSK未表现出急性毒性和慢性毒性。与之相比,PFOS则对水生生物表现出毒性,黑头软口鲦(Pimephales promelas)为最敏感物种,其96 h-LC₅₀为4.7 mg·L^-1;大型溞繁殖试验的NOEC为12 mg·L^-1。按GHS分类导则,属于中等毒性物质。可见,PFBSK较PFOS水生毒性明显降低。     

Molecular phylogeny of vestimentiferans collected around Japan, revealed by the nucleotide sequences of mitochondrial DNA

The phylogenetic relationships among local populations of undescribed vestimentiferan species that belong to the genera Lamellibrachia and Escarpia and had been collected at six sites around Japan were analyzed on the basis of the partial (1023 bp) nucleotide sequences of the mitochondrial gene for cytochrome oxidase I (COI), using a pogonophoran and a polychaete as outgroups. The identical amino acid sequence was deduced from the nucleotide sequence obtained from each of the vestimentiferans analyzed. The strong similarity among deduced amino acid sequences of COI suggested a close relationship between vestimentiferans and pogonophorans. On the basis of the phylogenetic relationships, the analyzed vestimentiferan populations were classified tentatively as five species. The genetic differentiation of vestimentiferans was suggested to occur bathymetrically as well as being a consequence of horizontal segregation. Two of these tentatively identified species inhabit both a hydrothermal area and a cold seep area, as is the case for some species of bivalves that belong to the genera Bathymodiolus and Calyptogena. Received: 28 August 1996 / Accepted: 2 October 1996