城市污水二级处理出水中沙门氏菌的PCR检测

建立了一种利用PCR检测城市污水二级处理出水中沙门氏菌的方法.采用膜吸附-洗脱法浓缩二级出水水样中的沙门氏菌,通过选用一对涵盖性和特异性均较强的引物139和141,对浓缩后的沙门氏菌进行PCR检测.利用正交试验法,对沙门氏菌PCR体系进行五因素四水平的试验,建立了沙门氏菌PCR的最佳体系.通过梯度PCR考察了退火温度对检测结果的影响,选择65℃作为退火温度,优化后沙门氏菌PCR体系的检测灵敏度可达0.314ngL.通过对已知细菌浓度的水样进行检测,确定了该法检测水样中沙门氏菌的灵敏度为2130CFUL.与传统MPN法的相比,该法在检测效果和检测效率上都优于MPN法.     

不同地表水体中四种典型肠道病原细菌的分布特性研究

利用实时荧光定量PCR方法,对西安市区洁净水体、轻度污染水体以及重度污染水体中的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏痢疾杆菌以及霍乱弧菌进行4个月的连续检测,结果表明：霍乱弧菌在各种地表水体,甚至城市污水中均未检出,而埃希氏大肠菌从各种水体检出的频度最高,且在水体受到轻微污染后即持续检出。在污染严重的水体中,埃希氏大肠菌检出的强...     

土壤环境中肠道致病菌的多重PCR检测研究初探

建立同时检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌等5种土壤常见肠道致病菌的多重PCR检测技术,为这些肠道致病菌感染的快速诊断提供实验依据.根据这些肠道病原菌的毒素基因、高度保守基因及特异性基因分别合成5对特异性引物,应用PCR扩增技术对目的菌株进行特异性检测.实验结果表明,5对寡核苷酸引物都具有较高的特异性和专一性,多重PCR检测限达到104cfu·g-1.多重PCR应用于土壤样品分析,极大的缩短了检测时间(仅需3～4h)、降低了检测成本,对控制病原菌的传播具有重要意义,可推广应用于环境监测、水源检测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域.     

城市地表水中肠道病原微生物与粪便污染指示菌的关系研究

本研究选择肠道病毒、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌作为城市水体中典型的肠道病原微生物,分别建立起相应的实时荧光定量PCR检测方法.对水源水、景观娱乐用水以及城市河流样品进行长期监测,考察典型肠道病原微生物的分布特征和变化规律.肠道病毒在各地表水体中都有检出,浓度大都在103copy·L-1以下.大肠埃希氏菌的含量在保护良好的水体和接纳城市污水的水体中有明显差别,而伤寒沙门氏菌和志贺氏菌通常出现在受粪便污染较重的水体中.统计学的分析结果显示各种水体中的肠道病原微生物检出浓度均符合对数正态分布规律.粪便污染指示菌与肠道病毒之间不存在显著的相关性,但却能在一定程度上反映典型肠道病原菌的存在情况.在大肠菌群或粪大肠菌群浓度为104CFU·L-1以上的样品中,伤寒沙门氏菌、志贺氏菌具有较高的阳性率.     

环介导等温扩增(LAMP)技术检测水源病原菌

微生物指标是水质安全的重要指标之一,但是由于技术原因,大部分病原微生物并未被纳入水质监测中。目前各类水质标准中只有病原指示微生物的指标,然而这些指标与病原微生物的相关性并不理想。因此,开发快速简便的病原微生物检测技术是改进水质生物检测和监测的关键。环介导等温扩增技术是一种快速检测DNA且不依赖昂贵检测设备的PCR技术。尝试利用该技术检测水中的8种常见指示菌和病原菌:总大肠杆菌、沙门氏菌、鲍氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7、小肠耶尔森氏菌、嗜肺军团菌、绿脓杆菌和结核杆菌,获得了针对其中5种细菌的毒力基因的特异性引物和最优等温PCR条件。环介导等温扩增技术的灵敏度可在45min内检测出100个基因拷贝,并能在原污水中对病原菌进行定性检测。     

污泥厌氧消化和后续处理中沙门氏菌杀灭及VBNC发生

应用最大或然数(MPN)培养法和反转录定量PCR(RT-qPCR)技术研究了4种污泥厌氧消化方式以及后续处理过程中沙门氏菌杀灭及有活性但不可培养(VBNC)状态的发生情况.中温厌氧消化(MAD)和高温预处理后中温消化(65℃+MAD)的沙门氏菌分别减少了2.8和5.6个数量级;高温厌氧消化(TAD)和高温-中温两相厌氧消化(TPAD)的沙门氏菌含量均低于检测限.沙门氏菌的杀灭速率常数排序为65℃+MAD>TAD>TPAD> MAD.结果显示高温对病原菌的灭活效果显著增加,高温短时预处理使得杀灭速率明显加快.TAD和TPAD的污泥VBNC沙门氏菌数量高于MAD和65℃+MAD 2个数量级,表明长时间的高温厌氧消化易导致沙门氏菌进入VBNC状态.消化污泥经过离心脱水后会出现沙门氏菌数量增加的现象,MAD、65℃+MAD、TAD和TPAD的消化污泥中沙门氏菌分别增加了1.1、2.4、3.7和2.5个数量级.但其中VBNC状态的沙门氏菌数量明显降低了1~3个数量级,表明消化后污泥中部分VBNC沙门氏菌在离心脱水过程中复活并生长,使得MPN检测得到的可培养沙门氏菌数量增加,初步解释了消化污泥经离心脱水后的病原菌再生长现象.消化污泥中沙门氏菌数量在室温放置过程中会进一步下降.     

Real Time PCR研究进展及其在海洋病原生物检测中的应用

Real Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,目前已广泛应用于分子生物学研究的各个领域.Real Time PCR技术秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏度检出等优点,同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等缺点,无需在反应结束后通过电泳操作确认扩增产物.目前,Real Time PCR可设计多对引物在同一反应体系中同时对多个靶基因进行扩增,实现多莺实时定量检测.Real Time PCR使PCR技术发生了质的飞跃,扩展了PCR技术的应用范畴,是一种具有划时代意义的技术.本文主要介绍Real Time PCR的主要原理、解析方法、技术发展趋势及其在海洋病原生物检测方面的应用.     

石油污染土壤非培养放线菌多样性分析

采取大港油田石油污染土壤,分析其石油污染状况。利用放线菌传统培养分离技术、荧光PCR检测技术以及放线菌16S rDNA克隆文库分析技术,探讨了石油污染土壤放线菌群落丰度及其结构特征。研究结果表明:石油污染导致了土壤放线菌群落丰度降低,而荧光PCR检测较传统的培养分离技术,更能准确、真实地反映土壤放线菌群落丰度。同时,放线菌16S rDNA克隆文库结果显示油污土壤非培养放线菌主要包括链霉菌属(Streptomyces)、分支杆菌属(Mycobacterium)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、微杆菌属(Microbacterium)、放线菌属(Actinomyces)、酸微菌属(Acidimicrobium)、地嗜皮菌属(Geodermatophilus)和乔治菌属(Georgenia)等8个类属,其主要种属与目前报道的具有石油烃降解功能的放线菌类群较为一致。该研究为从非培养放线菌角度修复石油污染土壤提供了重要的理论基础。     

城市污泥厌氧消化和脱水工艺对肠道病原菌的杀灭效应

运用最大或然数(MPN)培养法和定量PCR(qPCR)技术对不同城市污水处理厂污泥厌氧消化处理和脱水处理前后,污泥中埃希氏大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonellaspp.)和志贺氏菌(Shigellaspp.)含量的变化进行了研究.MPN检测结果表明,污泥中大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌数量经厌氧消化处理后明显下降,平均下降2～5个数量级,但qPCR检测结果显示,种病原菌平均下降1～2个数量级.脱水处理3后,污泥中的肠道病原菌含量基本没有变化,没有发生脱水后再生长现象.大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌含量分别在104～107、104～105和103～105MPN·g-1(以污泥干重计)之间.MPN和qPCR检测结果之间的差异性显示厌氧消化会造成肠道病原菌的有活性但不可培养状态(VBNC),同时也提示应用传统的培养检测方法检测病原菌含量和评定污泥排放的生物安全性时需慎重.     

实时荧光定量PCR技术对氨氧化细菌的研究

传统的PCR技术只能实现对核酸的定性检测而无法对其进行定量研究。随着分子生物学技术的发展,在传统PCR技术的基础上发展起来的实时荧光定量PCR技术实现了对核酸的定量研究。该技术是向常规PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,通过监测PCR反应过程中荧光信号的变化来实现对核酸的定量。实时荧光定量PCR技术具有应用范围广、灵敏度高、操作简单、工作量低等特点,在医学和微生物学领域已广泛地应用于疾病诊断、病毒定量检测、微生物群落结构分析及演替规律的研究。文章综述了该项技术的原理、特点及其在环境氨氧化细菌研究中的应用,同时也指出了该技术存在的问题及其发展应用前景。     

城市污水处理系统中沙门氏菌对四环素和磺胺甲恶唑的耐药性

耐药性病原菌的出现对人类健康构成潜在威胁. 为揭示耐药性沙门氏菌在城市污水处理系统中的存在和分布特征,从2座城市污水处理厂的不同处理单元中分离得到81株沙门氏菌,采用Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法考察它们对四环素和磺胺甲恶唑的耐药性. 利用PCR检测方法,分析耐药基因tetA、tetB、sul1、sul2和sul3在耐药沙门氏菌中的分布情况. 结果表明:分离得到的沙门氏菌对四环素和磺胺甲恶唑的耐药率分别为53.1%和40.7%,其中大部分菌株同时对这2种抗生素具有耐药性;从氯消毒出水中分离到的沙门氏菌对四环素和磺胺甲恶唑的二重耐药率比原污水中的高30.7%;城市污水中耐四环素和耐磺胺甲恶唑沙门氏菌中主要的耐药基因分别为tetA和sul3,经过污水处理系统之后耐药基因的分布发生了显著变化. 研究表明,污水处理厂的原水和排放水中沙门氏菌的耐药性问题已十分突出,可能对人类健康造成较大的风险.      

PCR技术在水体微生物检测中的应用

聚合酶链式反应(PCR)技术因其特异性强、灵敏度高以及快速简便等优点广泛应用于水体微生物的检测。综述了PCR技术的原理、方法及其在水体微生物检测中的研究进展。主要介绍了该技术应用于水环境中微生物病原体的检测、污水生物处理过程的监测与评价中的重要意义以及本实验室在该领域的研究进展。PCR技术为在分子水平上进行环境微生物的结构、多样性分析提供了有力的实验手段,有着广泛的应用前景。     

污水回用中主要病原菌解析及其紫外消毒效应

本研究以污水处理厂二级出水中的微生物为研究对象,通过454焦磷酸测序技术分析其群落结构组成,揭示了主要病源菌的种类和比例;通过培养法、q PCR、Q-RT-PCR这3种方法分析紫外剂量为60 m J·cm-2时对指示菌大肠杆菌和典型病原菌沙门氏菌及分枝杆菌的去除特性.结果表明,二级出水中共有11种病原菌,主要为梭菌属(2.96%)、弓形杆菌属(0.82%)和分枝杆菌(0.36%).60 m J·cm-2剂量的紫外消毒可以有效去除99.9%可培养的大肠杆菌和沙门氏菌,对可培养分枝杆菌的去除率不足90%.但是,该剂量紫外消毒对活性大肠杆菌、沙门氏菌和分枝杆菌的去除率较低,Q-RT-PCR检测方法可以较准确评价微生物的存活状态.60 m J·cm-2紫外剂量会导致大量病原菌进入具有活性但不可培养(VBNC)状态,需结合其他深度处理工艺进一步去除活性病原菌以保障污水回用的安全利用.     

基于PMA-定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究

建立了一种核酸染料propidium monoazide(PMA)与定量PCR技术联合选择性检测活性病原菌的技术(PMA-qPCR),以大肠杆菌作为模式菌,研究了氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活特性.结果表明,PMA染料能够分别去除99.94%和99.99%的来自非活性大肠杆菌和沙门氏菌的DNA,PMA-qPCR技术能够有效区分活性菌与非活性菌;PMA-qPCR技术得到的氯和一氯胺消毒对大肠杆菌的灭活曲线符合一级动力学方程,灭活速率常数分别为 2.24 L·(mg·min)^-1和0.0175 L·(mg·min)^-1,低于平板培养法得到的灭活速率常数;当大肠杆菌的去除率达到99%时,采用PMA-qPCR技术检测需要的ct值相比于平板培养法从0.6 mg·L^-1·min上升到0.9 mg·L^-1·min(氯消毒)和从20 mg·L^-1·min上升到超过100 mg·L^-1·min(一氯胺消毒);随着ct值的升高,常规qPCR的检测结果基本不变,因此常规qPCR不能够反映氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.作为一种新的表征消毒特性的检测技术,PMA-qPCR技术有助于更为准确地评价氯和一氯胺消毒对病原菌的灭活效果.     

PRB修复铬污染地下水反应介质研究进展

传统的抽出处理技术治理铬污染地下水时,耗时长、效率低、投资与成本高,限制了其广泛应用,近年来兴起的PRB技术很好地解决了这一问题。PRB技术的关键在于反应介质的研究,活性炭、沸石、铁屑等具有较好的除铬性能,但选择性差、易堵塞,混合反应介质可以克服其缺点。同时,对反应介质的研究大多处于实验室阶段,应加强其工程应用研究。     

废水处理中膜污染的检测方法

膜分离技术在废水处理领域的应用越来越广泛,而膜污染已经成为响膜分离技术应用和推广的主要瓶颈。要解决膜污染的问题,首先就要准确的检测出膜污染的情况及污染性质。文中总结了几种膜污染检测的方法,如表观分析法,理论模型法和间接表征法等方法,并分析了各种膜污染检测方法及其特点、应用情况,为膜污染的检测提供参考。     

猪粪便污染特异性分子标记筛选及其PCR检测方法的建立

肠道微生物群落在与其宿主长期协同进化过程中会形成大量的宿主-肠道微生物互作基因,这些互作基因具有一定的宿主肠道微生物特异性,利用其设计分子标记能有效识别粪便污染源.本研究首次利用竞争性杂交的方法富集猪粪便特异性基因,从中筛选出具有猪粪便特异性的基因片段,以此设计引物并建立相应的PCR检测方法,并对采集样进行应用调查.竞争性杂交富集的猪粪便特异性基因文库以拟杆菌群(Bacteroidetes)(43.2%)和梭状杆菌群(Clostridia)(19.5%)相似序列为主,其蛋白功能主要分为3大类:与信息贮存与加工有关(7.6%),与细胞加工及信息传导有关(12.8%)以及与代谢有关(22.0%).进一步针对功能蛋白序列筛选宿主粪便特异性分子标记.分析表明序列3-53-2对应引物可作为猪粪便污染的特异性分子标记,针对其建立的常规PCR方法对粪便DNA的检出限可低至0.01 ng·μL-1,且对实际样品具有较高的应用灵敏性(97%)和特异性.进一步对可能受污染水样进行猪粪便污染特异性检测,结果显示不同地区的阳性检出率高达75%~100%,证明了此方法的有效性,可为研究微生物示踪技术在非点源污染方面的应用提供一定的基础数据.     

PCR技术检测水中轮状病毒的研究进展

聚合酶链式反应,即PCR(polymerase chain reaction)技术,是一种快速扩增DNA或cDNA序列的方法.水环境中的轮状病毒是导致世界范围内婴幼儿腹泻的主要原因,严重危害着水质安全和人类健康.建立和完善水中轮状病毒灵敏、快速的检测方法对预防和控制水体疾病的暴发具有重要的意义.随着分子生物学技术的发展,PCR及其衍生技术因其具有高度灵敏性、特异性和准确性等特点,成为检测水中轮状病毒最常用的方法.本文综述了利用RCR及其衍生技术,包括逆转录聚合酶链式反应、逆转录半巢式和巢式聚合酶链式反应、多重逆转录聚合酶链式反应、免疫聚合酶链式反应、与免疫磁珠分离相结合的聚合酶链式反应、与细胞培养相结合的聚合酶链式反应及实时定量聚合酶链式反应等,检测水环境中轮状病毒的研究进展,并分析了这些PCR技术在检测水环境中轮状病毒时存在的问题及其应用前景.     

食品企业污水中细菌的基因芯片快速检测技术

食品企业污水中含有各种无机污物和有机污物．其中夹带的致病菌将导致多种疾病的爆发和流行．严重威胁着人类的健康。传统的细菌分离、培养和鉴定技术操作繁琐且耗时长（一般需4～7d）。为了快速．准确地检测食品企业污水中存在的细菌，建立了一种采用基因芯片技术对食品企业污水中常见细菌检测和鉴定的实验方法（需时4h）。实验中设计了8对特异引物并成功分成2组混合引物进行多重PCR反应：BI物Ⅰ为Kp＋HlyA＋InvA＋ipaH，引物Ⅱ为Cadc＋Oprl＋Ent＋23SrRNA。效果良好。实验确定了适宜的PCR反应循环数为35个循环，适宜的杂交温度为48℃。用实验制备的基因芯片对模拟水样检测结果的准确率达100％，说明该基因芯片对目的细菌特征基因的检测结果是可靠的。用该方法对食品企业污水水样进行检测具有高准确率，为今后更大规模的检测研究奠定了基础。