基于产毒基因sxtA的qPCR方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中的应用初探

麻痹性贝毒(paralytic shellfish toxins)包括石房蛤毒素(saxitoxin)及其同系物,是一类具有神经毒性的生物毒素,主要由甲藻和蓝藻产生。近年来,在蓝藻和甲藻中相继发现了一些与石房蛤毒素合成密切相关的基因,并建立了基于特定产毒基因的有毒藻类检测方法。长江口邻近海域是我国近海有害藻华的高发区,本研究尝试应用基于麻痹性贝毒产毒基因sxtA的qPCR检测方法,与有毒塔玛亚历山大藻复合种(I型和IV型)的qPCR检测方法和麻痹性贝毒的高效液相色谱方法相结合,对2013年春季长江口邻近海域两条断面上有毒藻和藻毒素的分布及变动情况进行了分析。结果表明,基于sxtA的qPCR检测结果与IV型塔玛亚历山大藻复合种的数量存在较好的相关性(r2=0.52,P0.05),说明IV型塔玛亚历山大藻复合种是采样期间长江口邻近海域麻痹性贝毒的主要来源;而样品中藻毒素含量与两种qPCR方法得到的有毒藻数量之间并没有明显相关性。可见,基于产毒基因的检测方法在长江口邻近海域有毒藻类检测中具有一定优势,但不足以准确反映该海域藻毒素的水平。     

应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究

亚历山大藻属的部分藻种(Alexandrium spp.)能够产生麻痹性贝毒毒素(PST),是重要的有害藻华(HAB)原因种.由于亚历山大藻属中的有毒和无毒藻种形态相似,且海水中亚历山大藻的细胞密度通常很低,因此,高灵敏度、高特异性的分子生物学方法在亚历山大藻检测方面具有重要的应用前景.塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是中国近海主要的有毒亚历山大藻藻种,大多属于塔玛亚历山大藻复合种第四类核糖体型(GroupⅣ,以往称为“亚洲温带核糖体型”).因此,本研究尝试将实时荧光定量PCR(qPCR)方法用于我国近海塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ)的快速检测,并对方法的特异性和灵敏度进行了检验.研究表明,所建立的qPCR方法能够特异性地检测我国近海不同海域分离的塔玛亚历山大藻复合种(GroupⅣ),方法具有良好的线性响应关系和较高的灵敏度,最低可检出5个藻细胞,具有良好的应用前景.然而,实验也发现,自我国近海分离的塔玛亚历山大藻复合种的不同藻株之间,以及处于不同生长阶段的藻细胞之间,qPCR检测结果存在显著差异,反映了目标藻核糖体RNA基因拷贝数的差异和变化对qPCR检测结果的影响.因此,建议在将qPCR方法用于不同海域亚历山大藻样品检测时,应采用该海域分离的藻株专门构建标准工作曲线,以减小定量分析误差.     

塔玛亚历山大藻对栉孔扇贝胚胎和早期幼虫的影响

塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense(藻株ATHK）能抑制栉孔扇贝Chlamys farreri受精卵的孵化和早期D型幼虫的存活。实验发现，暴露于密度为100和500cells/mL的塔玛亚历山大藻中，36h后，扇贝受精卵的孵化率分别为对照组的30%和5%，在实验范围内，三角褐指藻和赤潮异弯藻对受精卵孵化无影响，而另一塔玛亚历山大藻灌株ATCI02对受精卵孵 化有显著影响，指数生长前期时的藻对受精卵的毒性最大，原肠期之前各阶段的胚胎对塔玛亚历山大藻毒性最敏感，在密度为3000cells/mL以上的塔玛亚历山大藻中，早期D型幼虫存活和活力开始显著下降，在密度为5000cells/mL藻中暴露20d或10000cells/mL藻中暴露14d后，D型连续剧虫的存活率为0。塔玛亚历山大藻产生的毒性物质为非PSP毒素的一类未知毒素。     

塔玛亚历山大藻对鲈鱼幼鱼毒性效应研究

塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense)(ATHK)藻液能对鲈鱼（Lateolabrax japonicus)幼鱼（2．5cm）的存活有明显的影响，96h的半致死浓度为4000cells/mL。根据该藻PSP产毒量37．48fmol/cell（毒性为11pg(STX eq)/cell）计算，鲈鱼幼鱼的96h半致死藻毒素浓度相当于149．92fmol/L（毒性为44pg（STX eq)/L）。通过对塔玛亚历山大藻藻液各组分（都相当于8000cells/mL）：藻细胞悬浮液、去藻过滤液、细胞内容物以及细胞碎片的毒性大小比较研究，发现藻细胞的毒性作用很强，与藻液相近，细胞内容物也有显著影响，其他组分无显著的毒性作用，结果表明幼鱼摄入PS旨幼鱼致死的原因。较大的幼鱼（12cm）对有毒藻不敏感，暴露在1000cells/mL 10d后，存活率为100％。探讨了塔玛亚历山大藻的致毒机制和途径。     

光照强度和盐度对塔玛亚历山大藻生长的影响

采用一次性培养方法,在3个光照强度(3 000 lx、6 000 lx、12 000 lx)和7个盐度(10、15、20、25、30、35、40)下,研究了光照强度和盐度对塔玛亚历山大藻生长的影响。结果表明:光照强度对塔玛亚历山大藻的生长有显著性影响(p 0.05),盐度对塔玛亚历山大藻的生长有极显著性影响(p 0.01),光照强度和盐度的交互作用无显著影响(p 0.05)。无论在哪一种盐度条件下,在3 000 lx、6 000 lx和12 000 lx 3种光照强度中,均以 6 000 lx时塔玛亚历山大藻的藻细胞密度值最大,生长情况最好。而无论在哪种光照条件下,7个盐度梯度中,均以盐度为30时藻细胞的密度值最大,生长状况最佳。即最适宜塔玛亚历山大藻生长的光照强度为6 000 lx,盐度为30,此条件下藻细胞达到最大密度值为 65.93104 /mL,最大生长速率为0.3679,平均生长速率为 0.1553 。     

玉米叶对我国几种典型赤潮藻生长的影响研究

研究了玉米叶对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海洋卡盾藻(Chattonella marina)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)生长的影响,以期为筛选新的、无污染的、廉价高效的除藻剂提供思路,为不同的有害赤潮的治理提供参考.结果表明,玉米叶对塔玛亚历山大藻、海洋卡盾藻、赤潮异弯藻、东海原甲藻和球形棕囊藻生长的影响明显不同.玉米叶可显著抑制塔玛亚历山大藻、海洋卡盾藻和赤潮异弯藻的生长,但对东海原甲藻生长的影响不大,对球形棕囊藻的生长则有显著的促进作用.这些结果表明,玉米叶对赤潮藻生长的抑制作用存在一定的选择性,这种选择性与藻的种属与细胞结构并无明显的相关性.     

大型海藻与赤潮微藻以及赤潮微藻之间的相互作用研究

研究了2种大型海藻石莼(Ulva pertusa)和江蓠(Gracilaria lemaneiformis)对2种赤潮微藻:东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)和塔玛亚历山大藻(Alexandum tamarense)生长的影响以及2种微藻之间的相互作用,结果发现:①在大藻(石莼或江蓠)-微藻(东海原甲藻或塔玛亚历山大藻)的共培养体系中,石莼和江蓠均能明显影响与其共培养的微藻的生长,石莼对微藻生长的影响强于江蓠的作用.②在东海原甲藻-塔玛亚历山大藻的双藻培养体系中,东海原甲藻的生长受到明显的抑制作用,最终被完全灭杀;体系中塔玛亚历山大藻的生长未受到明显的影响.另外,塔玛亚历山大藻的培养液滤液能明显抑制东海原甲藻的生长,但东海原甲藻滤液对塔玛亚历山大藻的生长几乎没有影响.实验室条件下模拟二者相互作用的结果显示,塔玛亚历山大藻对东海原甲藻的抑制作用是其被后者抑制作用的17倍左右.③在大藻(石莼或江蓠)-东海原甲藻-塔玛亚历山大藻的多藻培养体系中,东海原甲藻和塔玛亚历山大藻的生长变化与它们在共培养体系中的变化非常类似.半数致死时间(LT50)法的检测结果显示:多藻培养体系对东海原甲藻的联合作用是协同作用,而对塔玛亚历山大藻的作用是相加作用.     

温度, 光照和盐度对产麻痹性贝类毒素藻类生长及产毒的影响

为探究温度、光照和盐度对产麻痹性贝类毒素（PSP）藻类生长及产毒的影响,本文选取了4株产麻痹性贝毒的藻种（塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）香港株（ATHK）、微小亚历山大藻（A.minimum）台湾株（AMSY）、链状亚历山大藻（A.catenella）南海株（ACSY）和链状裸甲藻（Gymnodinium catenatum）防城巷株（GCFC））在不同光照（60、120和200 μmol/（m2·s））、温度（16、22和28℃）和盐度（25、30和35）条件下生长及产毒的变化。结果显示,22℃最适宜4株藻的生长。低温可促进PSP的产生,除GCFC外,其余3株藻的单位细胞产毒量均随温度的升高而降低。ATHK和AMSY的生长与光照正相关。AMSY和GCFC的单位藻细胞产毒量与光照强度正相关,光照为120 μmol/（m2·s）时ATHK和ACSY产毒量最高,弱光均不利于4种藻产毒。盐度30条件下ATHK,AMSY和GCFC长势较好,高盐度（盐度35）促进ACSY的生长。ATHK的单位细胞产毒量均随盐度的升高而增加,AMSY和ACSY在高盐和低盐条件下产毒量均较大,GCFC则在盐度为30条件下产毒量最高。     

溶藻细菌BS03分离、鉴定及其对塔玛亚历山大藻生长的影响

从福建漳江口红树林区筛选出一株对产贝毒赤潮原因藻——塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamatense)具有强溶藻能力的细菌,命名为BS03,通过生理生化及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定,并探讨了菌株BS03对塔玛亚历山大藻的溶藻特性和溶藻代谢产物的初步性质.结果发现,菌株BS03属于微泡菌属(Microbulbifer sp.)相似性达99％;对塔玛亚历山大藻的杀藻效果具有一定浓度效应,在一定浓度范围内处理浓度越高,溶藻效果越好;菌株BS03对处于不同生长时期的塔玛亚历山大藻都表现出较好的杀藻效果,其中对处于延滞期的塔玛亚历山大藻表现出最佳的杀藻效果,处理96 h后,抑藻率达98.17％;不同生长期菌株对塔玛亚历山大藻溶藻作用无明显差异;菌株BS03通过间接作用方式溶藻,所分泌的胞外活性物质的分子量小于1 kDa,耐酸碱、具热稳定性,推测为非蛋白质、非核酸和非多糖类物质.     

不同N、P比例对微小亚历山大藻产毒特性的影响

亚历山大藻产毒特性一直是赤潮藻毒素研究中的热点,本文在N、P比例失调情况下研究微小亚历山大藻生长产毒规律,在20个不同N、比例下,对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)连续培养三代,比较其生长情况。采用柱前衍生高效液相色谱检测方法,对四种麻痹性贝毒(GTX14,GTX23,C12,STX)产毒情况进行分析;同时,通过对产毒前后培养基中N、P浓度的测定,比较了不用产毒情况下对N、P吸收利用量的差异。结果表明,N、P失调情况下,微小亚历山大藻仍然可以正常生长产毒;对N、P营养盐中任意一种线性增加其浓度,藻的细胞产毒能力呈现的是曲线的变化;在一种营养盐过剩的情况下,量少的营养盐才是产毒的制约因素,对制约营养盐的吸收量,与产毒能力的增加量,存在一定的正相关关系;而对于N、P比例长期失调的情况下,其细胞产毒能力所受的影响会随着藻世代的增加而累积或减弱。     

海洋底栖甲藻——利玛原甲藻(Prorocentrum lima)对三种赤潮藻的化感作用

为明确利玛原甲藻(Prorocentrum lima)对其它生物可能存在的化感作用,考察了利玛原甲藻培养物、无藻细胞滤液以及腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)租提物对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海洋卡盾藻(Chauondla marina)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)3种赤潮藻生长的影响.结果显示,共培养时利玛原甲藻对其它3种赤潮藻的生长有不同程度的抑制作用,其生长也受到3种赤潮藻的影响;无藻细胞滤液对东海原甲藻和海洋卡盾藻有抑制作用,其中对东海原甲藻的抑制作用更明显.但对塔玛亚历山大藻的影响不大;比较而言,DSP粗提物对3种藻的影响最为明显,甚至可完全抑制海洋卡盾藻的生长.这些结果提示.利玛原甲藻与赤潮藻间存在交互抑制作用,可能会通过分泌化感物质、细胞间接触抑制等途径抑制其它藻的生长;利玛原甲藻具有一定的化感作用,但DSP毒索并非利玛原甲藻发挥化感效应的主要原因.     

两种抗生素对塔玛亚历山大藻生长和产毒的影响

论文以中国南海筛选的一株塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense C101为研究对象,研究了两种抗生素,氨苄青霉素(ampicillin,Amp)和新霉素(neomycin,Nm)对A.tamarense C101细胞生长、形态以及毒素含量的影响.结果表明:和空白对照组相比,经1 500μg/mL Nm...     

酚酸类化感物质对塔玛亚历山大藻生长的影响

探讨了不同浓度酚酸类化感物质香草醛、没食子酸和(+)-儿茶素对赤潮藻-塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)生长的影响.结果表明,没食子酸和(+)-儿茶素的浓度为4,20,40mg/L时均能有效抑制塔玛亚历山大藻的生长,且具有明显的剂量依赖关系,浓度为40mg/L时,藻的生长被完全抑制.香草醛的浓度为40mg/L时对塔玛亚历山大藻的生长有明显的抑制作用.没食子酸和(+)-儿茶素对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用比香草醛明显,提示香草醛、没食子酸和(+)-儿茶素抑制赤潮生物生长的机制可能与自氧化有关.     

对羟基苯甲酸对2种赤潮微藻生长的影响

通过测定藻细胞密度和细胞体积,观察藻细胞形态,分析藻细胞内硝酸还原酶(NR)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量等生理指标的变化,研究了对羟基苯甲酸对2种赤潮微藻-米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻生长的影响。结果表明,浓度1.6mmol/L时,对羟基苯甲酸能明显地抑制这两种微藻的生长。同时发现,添加对羟基苯甲酸的藻细胞运动能力降低,藻细胞体积减小,并出现空洞、破碎以及部分抱团现象。进一步研究发现,对羟基苯甲酸明显降低了塔玛亚历山大藻NR和SOD活性,但对POD活性无明显影响;其低浓度时能增大米氏凯伦藻NR、POD和SOD活性,高浓度时则明显降低此三种酶的活性;它显著提高了两种微藻细胞内的MDA含量。     

凤眼莲根系丙酮提取物抑制赤潮藻类生长的机制研究

为了探讨凤眼莲根系丙酮提取物抑制塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长的机制,筛选和发现新的、高效、低毒或无毒、能迅速控制赤潮生物生长的除藻剂.对比分析了凤眼莲根系丙酮提取物中不同物质的抑藻效果,探讨了凤眼莲根系丙酮提取物抑藻的主要化学基础.通过考查主要抑藻物质对藻细胞可溶性蛋白质、丙二醛含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响,探讨其抑藻机理.结果表明,浓度高于5 mg·L-1以上的N-苯基-2-萘胺,3 d后能保持对塔玛亚历山大藻抑制率超过50%;浓度为70μL·L-1的亚油酸对塔玛亚历山大藻的抑制率约为40%;浓度为70 μL·L-1的壬酸第3天可以达到85%的抑藻率,但随后藻密度有反弹.实验浓度范围内的亚油酸甘油酯和丙酰胺对塔玛亚历山大藻的抑制作用不明显.培养液中加入一定量N-苯基-2-萘胺后,藻体中的可溶性蛋白质和丙二醛含量有应激性升高,超氧化物歧化酶活力呈下降趋势.研究结果表明,N-苯基-2-萘胺可能是凤眼莲根系丙酮提取物中的主要抑藻物质;其可能通过自由基反应破坏藻细胞的结构,从而达到抑藻效果.     

玉米秸秆对塔玛亚历山大藻生长的影响及化学基础研

以塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)为材料,观察了玉米茎秆和玉米叶对塔玛亚历山大藻生长的影响,比较了灭菌、未灭菌玉米叶的抑藻活性,并对玉米叶抑制藻类生长的化学基础进行了分析,以期为筛选和发现新的高效除藻剂提供思路.结果表明,玉米秸秆能显著抑制塔玛亚历山大藻的生长,玉米叶的抑藻作用强于玉米茎秆.0.5 g/Ｌ的玉米叶对密度为1.69×１０６ 个/L的塔玛亚历山大藻的生长有明显的抑制作用.灭菌、未灭菌玉米叶对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用无明显差别,表明微生物不是玉米秸秆发挥抑藻作用的主要原因.玉米叶不同溶剂粗提物对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用不同,石油醚、二氯甲烷粗提物的抑藻活性明显强于乙酸乙酯和正丁醇粗提物.GC-MS分析结果显示,石油醚、二氯甲烷粗提物中主要含十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、棕榈酸等脂肪酸类物质,提示长链脂肪酸可能是玉米秸秆抑藻的主要化学成分.     

海洋卡盾藻无细胞滤液对赤潮微藻的作用及其与微藻的共培养

实验模拟条件下,研究了海洋卡盾藻无细胞滤液对四种微藻生长的影响及其与东海原甲藻和塔玛亚历山大藻的共培养。结果表明:卡盾藻无细胞滤液对三角褐指藻、东海原甲藻和塔玛亚历山大藻细胞的生长速率都有显著的抑制效应(P<0.01),而对中肋骨条藻的生长抑制作用较弱,当卡盾藻滤液在高浓度(15 mL、20 mL)/40 mL下,中肋骨条藻的生长才受到显著抑制,而低浓度下没有明显影响。海洋卡盾藻与甲藻的共培养明显促进了卡盾藻的生长,抑制了甲藻的生长,对东海原甲藻的抑制作用较强。共培养的结果可能是由于海洋卡盾藻与甲藻之间存在化感作用或营养盐竞争作用,而无细胞滤液对微藻的作用表明海洋卡盾藻对微藻产生化感效应。     

玉米秸秆对塔玛亚历山大藻生长的影响及化学基础研究

以塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)为材料,观察了玉米茎秆和玉米叶对塔玛亚历山大藻生长的影响,比较了灭菌、未灭菌玉米叶的抑藻活性,并对玉米叶抑制藻类生长的化学基础进行了分析,以期为筛选和发现新的高效除藻剂提供思路.结果表明,玉米秸秆能显著抑制塔玛哑历山大藻的生长,玉米叶的抑藻作用强于玉米茎秆.0.5 g/L玉米叶对密度为1.69×106个/L的塔玛亚历山大藻的生长有明显的抑制作用.灭菌、未灭菌玉米叶对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用无明显差别,表明微生物小是玉米秸秆发挥抑藻作用的主要原因.玉米叶不同溶刺粗提物对塔玛亚历山大藻生长的抑制作用不同,石油醚、二氯甲烷空粗提物的抑藻活性明显强于乙酸乙酯和正丁醇粗提物.GC-MS分析结果显示.石油醚、二氯甲烷粗提物中主要含十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、棕榈酸等脂肪酸类物质,提示长链脂肪酸可能是玉米秸秆抑藻的主要化学成分.     

杉木粉对塔玛亚历山大藻生长的影响

研究了杉木粉对塔玛亚历山大藻生长的影响。结果显示,一定量的杉木粉对塔玛亚历山大藻的生长具有明显的抑制作用。杉木粉用量为0 .5g/L时,3d后对藻密度为2 .88×10 6 和6.0 8×10 6 /L的塔玛亚历山大藻的抑制率高达80 %。提示杉木粉可能是一种潜在的可有效控制赤潮的新材料。     

长江口赤潮多发区潜在有毒藻类和赤潮毒素的初步调查

通过长江口赤潮多发区2003年-2005年的有毒藻类和贝类原产地赤潮毒素的监测,初步结果表明该海域存在多种潜在有毒藻类,主要包括产麻痹性贝毒(PSP)的链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、塔玛亚历山大藻(A．tamarens),产腹泻性贝毒(DSP)的渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata,)、具尾鳍藻(D．caudata)、倒卵形鳍藻(D．fortii);产记忆缺失性贝毒(ASP)的尖刺拟菱形藻(Pseudo-Nitzschia pungens)、多列拟菱形藻(P．multiseries)、柔弱拟菱形藻(P.delicatissima )和多纹拟菱形藻(P．multistriata);产神经性贝毒(NSP)的短凯伦藻(Karenia brevis),其他有毒有害藻类包括红色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum)、Heterocapsa circularisquama、米氏凯伦藻(K．mikimotoi)、Chatenela marina,Heterisigma akashiwo等其他有毒藻类。有毒藻类种类5、6月份较多,产腹泻性贝毒(DSP)和产记忆缺失性贝毒(ASP)的潜在有毒藻类常年均在该海域出现,这些有毒有害藻类多数密度并不高,Heterocapsa cirularisquama曾在2003年和2005年两次形成赤潮,并导致部分养殖贻贝死亡,米氏凯伦藻于2005年5-6月在长江口海域形成大规模赤潮,并导致养殖鱼类死亡。与有毒藻类监测同步开展了赤潮毒素检测,长江口贝类赤潮毒素检出时段主要集中在5-8月份,麻痹性贝毒和腹泻性贝毒的检出率分别为5％和15％左右,敏感种类为养殖的紫贻贝。