番茄SIZ1-like1基因的克隆与功能

SUMO(Small ubiquitin-related modifi er)化修饰是植物体内一种重要的蛋白质功能调节方式.它调控植物细胞中蛋白的降解与定位,植物抗性及激素调节等.SIZ1是SUMO的E3连接酶并在SUMO化中起重要作用.为了解SIZ1基因在番茄中的功能,成功克隆番茄(Solanum lycopersicum)SIZ1基因(SIZ1-like1)并构建番茄SIZ1-like1RNA干涉和过表达载体后,通过农杆菌介导转入野生型番茄,成功获得6个独立的转基因阳性植株.荧光定量PCR(Real-time PCR)分析野生型番茄中SIZ1-like1基因的组织表达特异性,发现SIZ1-like1在植物的各个组织中都有表达.构建SIZ1-like1黄色荧光蛋白融合表达载体,通过对SIZ1-like1融合黄色荧光蛋白转基因番茄的根尖进行荧光显微观察,证实番茄SIZ1蛋白定位于细胞核.干旱胁迫实验分析显示,过表达转基因植株抗旱性强于野生型,且脯氨酸含量是野生型的3倍左右,而RNAi植株抗旱能力则较弱.因此SIZ1基因对番茄抗旱起到了正调控作用.     

异源表达胡杨PeCPD基因提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抗性

油菜素类固醇(Brassinosteroids,BRs)在调节植物生长发育和提高植物对非生物胁迫的抗性中起着重要作用,CPD(Constitutive Photomorphogenesis and Dwarfism)基因编码一种甾醇类23a羟化酶,在BR的生物合成中发挥着重要作用.本研究克隆胡杨Pe CPD基因的c DNA序列,并利用农杆菌介导法,将Pe CPD基因植物过表达载体p BI121-35S::Pe CPD转化野生型烟草,筛选得到Pe CPD基因过表达的转基因烟草植株,并利用Na Cl、高氮和甘露醇分别对转基因和野生型烟草进行胁迫处理,检测转基因烟草的耐受性和相关的生理生化指标.结果表明:(1)在正常条件下,转基因烟草的鲜重是野生型烟草的1.47倍;(2)在Na Cl、高氮以及甘露醇的胁迫处理下,转基因烟草植株的根长、叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著高于野生型植株,抗氧化酶SOD和POD活性以及渗透调节物质脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量也同样表现为转基因烟草显著高于野生型,而野生型植株的丙二醛(MDA)含量显著高于转基因植株.因此在烟草中异源过表达胡杨Pe CPD基因不但能够增加烟草的生物量,而且能够提高烟草对盐、高氮和干旱胁迫的抵抗能力.     

番茄HP1和HP2基因RNA共干涉载体的构建及遗传转化

番茄HP1和HP2是色素积累的负调控因子,在光形态建成和色素积累调控中起着重要作用.将番茄HP1、HP2基因片段导入到植物表达载体pBI121,用番茄果实特异表达的TMF7基因的启动子替换原有的CaMV 35S启动子,构建果实特异表达HP1、HP2双基因RNA共干涉植物表达载体pBI121-TMF7-HP1HP2.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株果实内HP1、HP2的表达量均明显低于野生型植株果实.转基因植株果实叶绿素含量比野生型明显升高,而叶片中的叶绿素含量无明显差异.该研究结果为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路.图6表2参15     

番茄ARF4基因果实特异RNAi载体的构建及遗传转化

构建ARF4基因果实特异表达的RNA干涉载体,对转基因番茄果实进行初步分析,可为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试.利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF4基因全长,将番茄ARF4基因正反向重复序列片段导入到植物表达载体pBI121上,启动子是番茄果实特异表达的TFM7.将构建的ARF4基因果实特异RNA干涉载体pBI121-TFM7-A4Ri通过根癌农杆菌介导转入到野生型番茄中,进而对转化获得的植株进行了阳性鉴定.分别以转基因番茄和野生型番茄为材料,分析ARF4在果实中的表达水平,测定绿熟期果实叶绿素含量、果实的单果重量和果皮厚度.酶切证实pBI121-TFM7-A4Ri果实特异表达载体构建成功,而且,PCR检测也得到阳性转基因株.半定量RT-PCR分析显示,转基因番茄果实中ARF4的表达量明显低于野生型果实.转基因番茄果实的叶绿素含量、单果重量和果皮厚度都比野生型有提高.因此,ARF4果实特异表达的RNAi方法能够改良番茄果实品质.     

编码水稻胞外核苷酸双磷酸酶基因的表达特性

NTPDase(Nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase,核苷酸双磷酸酶)在哺乳动物巾分布于细胞膜,可以水解细胞外ATP和其他核苷酸,从而调控胞外核苷酸代谢及信号应答.根据水稻NTPD基因序列设计引物,在不同胁迫条件样品中,通过PCR扩增水稻NTPD基因,结果表明水稻NTPD基因表达水平在盐胁迫样品中升高.为进一步分析水稻NTPD基因的功能,构建了该基因的过量表达、RNA干涉载体,通过根癌农杆菌介导转入水稻品种日本晴并获得阳性植株.半定量RT-PCR分析达到过量表达和干涉日的.在盐胁迫条件下,TO代过表达转基因植株表现出一定程度的抗胁迫能力,RNA干涉转基因植株的生长则受到抑制.图7表3参20     

转codA基因杨树耐旱性增强的生理机制

研究转胆碱氧化酶(codA)基因杨树对干旱胁迫的响应机制可为杨树耐旱育种及应用提供理论依据.在盆栽条件下研究土壤干旱胁迫及复水对转基因杨树(T)和野生型(NT)生长的影响及叶片中MDA、H_2O_2、甜菜碱含量和抗氧化酶活性等生理指标的影响.结果显示:(1)干旱胁迫后,转基因杨树和野生型的株高、总生物量增长都减慢,但转基因杨树生长状况优于野生型且复水后恢复较快;胁迫5周后,转基因杨树地上地下部的干重分别降低了21.01%和22.97%,而野生型地上地下部的干重则较对照分别降低了47.21%和52.11%,与正常供水相比,转基因植株地上地下部的干重显著高于野生型.(2)杨树叶片中过氧化氢(H_2O_2)、丙二醛(MDA)含量在干旱胁迫后先增加后降低,复水后继续下降,但转基因杨树积累量低于野生型;干旱胁迫下,转基因杨树叶片中游离脯氨酸和甜菜碱的含量显著高于野生型,干旱胁迫3周后,转基因杨树叶片中甜菜碱含量是野生型的2.38倍.(3)随干旱时间延长,杨树叶片中SOD、POD、CAT和APX酶活性逐渐增加,复水后下降,除POD外,转基因杨树抗氧化酶活性普遍高于野生型.本研究结果说明渗透调节物质含量的增加及抗氧化能力的增强是转基因杨树耐旱性和复水后恢复能力增强的内在生理机制.     

番茄微管结合蛋白EB1调控盐胁迫应答

微管结构的动态受微管结合蛋白(Microtubule-associated proteins,MAPs)调控,在植物的生长发育和环境信号响应中有重要作用. EB1(End-binding protein 1)是微管正末端特异结合的MAP,蛋白同源序列比对搜索显示番茄基因组有2个EB1基因,SlEB1a(Solyc03g116370)和SlEB1b(Solyc02g092950).构建SlEB1a基因的过表达番茄植株和同时干涉SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi番茄植株,并分析它们对微管解聚药物戊炔草胺和盐胁迫的敏感性.结果证明番茄微管结合蛋白EB1(SlEB1)在盐胁迫应答中有重要作用.与野生型番茄植株相比,过表达番茄植株对1μmol/L微管解聚药物戊炔草胺更加敏感,而RNAi植株对1μmol/L戊炔草胺更加耐受,与此相反,过表达番茄植株对100 mmol/L NaCl更加耐受而RNAi番茄植株对100 mmol/L NaCl更加敏感.因此,SlEB1可能通过负调控番茄周质微管的稳定性而正调控番茄对盐胁迫的应答;本研究结果可为进一步研究植物周质微管动态在盐胁迫应答中的作用机制奠定基础.     

水稻锌指蛋白基因OsWIP6的克隆、表达及RNAi载体转化

为了解水稻C2H2型锌指蛋白转录因子基因的表达调控机理及生物学功能,克隆了水稻的一个C2H2型锌指蛋白转录因子基因(OsWIP6),并构建其RNA干涉植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得转基因植株.生物信息学分析显示,OsWIP6氨基酸序列与拟南芥两个WIP家族转录因子高度同源.组织差异性表达分析表明,该基因在水稻花发育上具有表达偏向性.与野生型相比,转基因水稻表现为抽穗延迟,结实率及千粒重降低,半定量分析显示转基因植株OsWIP6表达量明显下降.因此,推断OsWIP6基因与水稻育性密切相关.     

烟草异源过表达胡杨PeGRF6/8a对不同逆境的响应

14-3-3蛋白是一种广泛存在于动植物体内的高度保守的蛋白家族,通过与各种靶蛋白之间的互作,参与生物体内各种生理生化过程和代谢反应,且在生物与非生物胁迫响应中发挥着重要作用.为明确胡杨PeGRF6/8a在非生物胁迫中的功能,克隆了胡杨14-3-3蛋白家族中PeGRF6/8a的cDNA序列,构建该基因的植物过表达载体pBI121-35S::PeGRF6/8a,并采用农杆菌介导法将其转化野生型烟草.对获得的异源过表达烟草进行以下处理:(1)浓度为1μmol/L和2.5μmol/L脱落酸(Abscisic acid,ABA)处理条件下的种子萌发实验;(2)低氮(2.5 mmol/L KNO_3)和高氮(150 mmol/L KNO_3)胁迫下的根长对比实验;(3)1/2霍格兰(Hongland)营养液水培实验,分别设置对照(CK)、低氮(0.2 mmol/L KNO_3)、高氮(150 mmol/L KNO_3)和盐胁迫(150 mmol/L NaCl)4个处理.结果显示:(1)在ABA处理下,转基因烟草种子的萌发率较野生型低,且在2.5μmol/L处理下更加显著;(2)低氮处理下,转基因烟草的根长显著短于野生型烟草的根长,而高氮处理下的结果相反;(3)水培实验中,低氮和盐胁迫处理下,转基因烟草与野生型相比,其下部的叶片明显变黄或萎焉,所含叶绿素和类胡萝卜素含量明显降低,抗氧化酶SOD以及渗透调节物质脯氨酸和可溶性蛋白的含量也显著降低,而叶片中丙二醛(MDA)的积累量却显著升高;高氮胁迫下,野生型烟草的萎蔫速度要显著快于转基因烟草,其转基因植株的生理指标除MDA积累量外均显著高于野生型.上述结果表明在烟草中异源过表达胡杨PeGRF6/8a能够降低植物对低氮和盐的耐受性,但可以增强植物对高氮的耐受性.(图9参31)     

水稻DDB1基因的表达特性及功能分析

利用RNA干涉技术构建水稻DDB1(Damaged DNA binding protein 1)基因不同启动子驱动植物表达载体,DDB1-RNAi和DDB1-glu-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入水稻愈伤,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,与野生型植株相比,两组转基因植株幼叶内DDB1的表达量...     

过量表达水稻OsP5CS1和OsP5CS2基因提高烟草脯氨酸的生物合成及其非生物胁迫抗性(英文)

为了解水稻OsP5CS基因在非生物胁迫中的生物学功能及其生理生化作用,将P5CS基因的两个水稻同源基因OsP5CS1和OsP5CS2同时构建到植物表达载体pHB上,并通过农杆菌介导的遗传转化法转入烟草,经过鉴定转基因植株,成功获得9个独立的转基因阳性植株.选取野生型和其中的3个转基因植株后代,分别测定它们在不同的胁迫条件下幼苗的根长、鲜重以及脯氨酸、过氧化氢和丙二醛的含量.结果显示:在200 mmol/L NaCl、300 mmol/L甘露醇(Mannitol)、300μmol/L CuSO4胁迫条件下转基因植株的平均根长、平均鲜重、平均脯氨酸、平均过氧化氢含量和平均丙二醛的含量分别为野生型的1.3-2.3、1.9-3.9、1.8-3.2、51%-61%和62%-76%.因此在烟草中过表达OsP5CS基因,可以显著增加脯氨酸含量,降低烟草在非生物胁迫条件下的氧化损伤.图6参31     

异源表达胡杨PeBAK1;1基因增强烟草对Pst DC3000的抗性

BAK1(BRI1-associated receptor kinase 1)是一个富亮氨酸重复序列(LRR)的膜受体蛋白激酶,除参与植物油菜素内酯信号的转导外,还可以结合其他的LRR-RLKs蛋白来启动植物的先天免疫反应.为明确胡杨Pe BAK1;1基因在烟草中抗Pst DC3000(丁香假单胞杆菌种番茄致病变种)的功能及其在植物抗病中的调控方式,克隆胡杨Pe BAK1;1基因c DNA序列构建Pe BAK1;1基因的过量表达载体p BI121-35S::Pe BAK1;1,并利用农杆菌介导法将其转化野生型烟草,筛选获得Pe BAK1;1基因过表达的转基因烟草植株.生物信息学分析结果表明胡杨Pe BAK1;1蛋白具有植物SERK家族的全部结构特征,系统进化树分析表明胡杨Pe BAK1;1与毛果杨Pt BAK1的序列同源性最高;组织表达分析表明Pe BAK1;1基因主要在根和叶中表达;Pst DC3000侵染试验结果显示,野生型烟草植株接种Pst DC3000后表现出明显的感病症状,而Pe BAK1;1基因过表达的转基因烟草植株表现出明显的抗病症状;Real-time PCR及quantitative real-time-PCR分析结果表明,与野生型相比,转基因烟草中抗病防御相关基因PR1、PR3、PR4和PR5的表达量显著升高,且参与植物生长发育与先天防卫反应的基因BIR1和BON1的表达量也明显升高.上述结果表明,异源表达胡杨Pe BAK1;1基因在烟草抗Pst DC3000过程中起正调控作用,能够增强植物的抗病能力.     

种子特异启动子At2S3驱动热激转录因子AtHsfA6a提高烟草热抗性

特异启动子指导外源基因在某一特定时空表达,避免个体多余营养的浪费,在作物品质及逆境适应性改良中具有重要应用潜力.采用种子特异启动子联合抗性基因的方法,对拟南芥种子特异启动子At2S3和热激转录因子At Hsf A6a进行克隆,构建p BI121双元表达载体(p At2S3::At Hsf A6a),利用农杆菌菌株转化烟草,获得转基因烟草稳定株系,并进行种子抗高温胁迫萌发实验.结果显示:At Hsf A6a表达量随高温胁迫持续而不断积累,45℃高温处理后,热激转录因子At Hsf A6a的表达量最高上调28倍.转基因烟草株系(L2,L3)与野生型烟草(WT)相比,在45℃高温处理12 h、18 h和24 h后,最终萌发率分别为100%、98%和80%,98%、94%和76%以及97%、92%和70%.根长实验表明转基因株系L2和L3的根长为未处理时的74%和60%,而WT根长为未处理时的52%.上述结果说明超表达烟草株系的萌发和根系生长较之WT对热激处理更不敏感,呈现出更高的抗性;可为种子特异启动子加抗性基因的组合提高转基因植株抗胁迫能力提供直接实验证据,为基因工程育种提供种子特异启动子和抗胁迫新策略.     

铁皮石斛外源lea3基因的转化及耐盐性分析

利用基因枪法将来源于大麦(Hordeum vulgare L.)的抗旱耐盐基因lea3导入铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)的类原球茎(PLBs)中,经膦丝菌素类除草剂PPT筛选2次获得抗性PLBs,于无选择压下分化获得不定芽,再经PPT筛选和生根壮苗培养获得转化植株.对转化植株进行除草剂PPT叶片涂抹检测和lea3基因的PCR检测,表明lea3基因已整合到6个株系7株铁皮石斛转化植株基因组中,转化频率为1.05%.与对照相比,获得的转基因植株的耐盐胁迫能力明显增强,表明遗传转化lea3基因可用于石斛抗旱耐盐新品种的选育.     

拟南芥VTE1过量表达可以增加维生素E含量和提高烟草植株耐盐性

维生素E在动物细胞内具有抗氧化等重要作用,但在植物体内的功能却鲜为人知.本实验利用CaMV35S启动子与来源于拟南芥的编码生育酚环化酶(TC)的cDNA(VTE1)构建的嵌合表达载体,以根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草W38.实验结果表明,具有卡那霉素抗性的再生植株经RT-PCR检测,得到了与阳性对照一致的495bp的目标片段;转基因植株的VE含量比对照植株高2倍左右,个别株系高达11倍.实验还发现,在耐盐性实验中转基因植株对盐的抗性明显高于野生型烟草;同时,在不同盐浓度(150、250mmol/L)胁迫下转基因植株VE含量比未转化植株增加了1.3~1.8倍,首次证明VTE1与植物耐盐性之间的关系.图7参30     

拟南芥VTE1过量表达可以增加维生素E含量和提高烟草植株耐盐行

维生素E在动物细胞内具有抗氧化等重要作用，但在植物体内的功能却鲜为人知．本实验利用CaMV 35S启动子与来源于拟南芥的编码生育酚环化酶（TC）的cDNA（VTE1）构建的嵌合表达载体，以根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草W38．实验结果表明，具有卡那霉素抗性的再生植株经RT-PCR检测，得到了与阳性对照一致的495bp的目标片段；转基因植株的VE含量比对照植株高2倍左右，个别株系高达11倍．实验还发现，在耐盐性实验中转基因植株对盐的抗性明显高于野生型烟草；同时，在不同盐浓度（150、250mmoL／L）胁迫下转基因植株VE含量比未转化植株增加了1．3～1．8倍，首次证明VTE1与植物耐盐性之间的关系．     

水稻OsGPCR基因的克隆及遗传转化分析

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)基因家族是目前已知最大的膜受体超家族,参与生物的生长发育调控和激素应答.通过RT-PCR分离了水稻中一个具有7次跨膜(Seven transmembrane,7TM)结构域的OsGPCR候选基因;分析该基因启动子序列,发现它含有赤霉素GA应答相关元件.为分析其功能,分别构建OsGPCR过表达和RNA干涉载体,并通过农杆菌介导法转化获得转基因水稻植株.实验结果表明,较之野生型,过表达转基因植株对赤霉素反应更敏感,RNA干涉植株则反之.     

BnGID1基因过量表达对甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1株高的恢复

在正常株高油菜中克隆了与拟南芥矮化突变相关基因AtGID1同源的BnGID1基因全长cDNA目的片段,将其正向插入表达载体pFGC5941上的CaMV35S启动子下游,构成该基因过量表达载体pFGC5941-BnGID1.经根癌农杆菌介导,导入甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1基因组,通过PCR及半定量RT-PCR检测,确定得到抗性转基因植株23株.移至大田生长,观察结果显示,转基因植株明显高于对照矮化突变体NDF-1,平均高出49.05cm.结果表明,BnGID1基因过量表达能够使甘蓝型油菜矮化突变体NDF-1株高得到较大程度的恢复.图7表2参16     

表达马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的转基因烟草抗病机制

根据已报道的马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)核苷酸序列，克隆了PVY^N外壳蛋白(CP)基因，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导的方法，转化烟草NC89，获得了38株PCR呈阳性的转基因植株．攻毒试验发现，转基因植株对PVY^N的抗性水平存在着差异，其中有4株表现为高度抗病性．Southern blot表明，PVY^N CP基因已经整合到烟草染色体中，转基因的拷贝数与植株的抗病性成正相关．Northern blot表明，PVY^N CP基因在RNA水平上得到了表达，而且PVY^N CP RNA在细胞中的积累量与转基因植株的抗病性呈明显的负相关．Western blot表明，高度抗病植株未检测到转基因CP蛋白质，而抗病和感病植株都检测到了PVY^N CP蛋白，且不同抗性的转基因植物中转基因蛋白质的积累有一定的差异．实验结果表明，表达PVY^N CP基因的转基因烟草其抗病机制类似于转录后的基因沉默，即抗病件可能是RNA介导的．     

番茄SlNAC1基因启动子的盐应答功能分析

番茄NAC转录因子编码基因SlNAC1受假单胞菌、盐、干旱和低温等多种生物和非生物胁迫诱导表达,但其转录调控机制仍不清楚.为研究SlNAC1的盐应答转录调控机制,分离SlNAC1基因的启动子并分析其盐应答功能.构建4个5′-缺失的SlNAC1启动子(起始密码子上游2 039 bp、1 508 bp、1 373 bp和777 bp)驱动的GUS基因表达载体,并利用农杆菌介导法分别转化烟草(Nicotiana benthamiana),随后对转基因植株进行NaCl处理和GUS染色分析.结果显示,未经NaCl处理的转基因植株均不被明显染色,而NaCl处理后,除777 bp启动子转基因植株外,2 039 bp、1 508 bp和1373 bp启动子转基因植株都被明显染色.这说明SlNAC1启动子中盐应答元件位于-1 373 bp和-777 bp之间.结合该区间有4个盐应答元件——GT1GMSCAM4元件(核心序列为GAAAAA)的预测分析结果,推断这4个GT1GMSCAM4元件中的一个或者多个协同负责SlNAC1基因的盐应答转录调控.这4个GT1GMSCAM4元件将用于筛选SlNAC1盐应答的转录调控因子.(图4表1参28)