川芎咖啡酸-O-甲基转移酶基因密码子偏好性与进化分析

咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是苯丙烷类代谢途径中的一个关键酶,研究其密码子偏好性对开展该基因的异源表达与分子调控研究有重要指导意义.利用Codon W、EMBOSS、SPSS与Origin等在线服务器及软件,首先分析川芎等不同植物来源COMT基因的密码子偏好性,随后以川芎COMT为重点,比较其与大肠杆菌、酵母、拟南芥与烟草等模式生物的密码子使用频率.结果表明,单子叶植物COMT基因的密码子偏好性较强,而低等植物与双子叶植物COMT基因的密码子偏好性较弱.分析COMT基因密码子偏好性与核酸序列,发现亲缘关系较近的物种不仅具有较高的核酸序列相似度,并且具有相似的密码子偏好性,推测这种现象是由于密码子偏好性的形成主要受到自然选择的影响. COMT作为一个起源古老的基因,分析其密码子偏好性对了解植物进化关系有一定作用.川芎COMT体现出与其他双子叶植物相近的密码子偏好性,其GC含量与GC3s均小于50%,偏好以A/T编码,偏好性极强(RSCU 2)的密码子有7个,ENc为51.38,整体密码子偏好性较弱.与大肠杆菌相比较,酵母可能是其更好的外源表达系统.较之拟南芥,烟草更合适作为川芎COMT的遗传转化受体.本研究表明拟南芥、烟草都可作为Lc COMT遗传转化受体系统的候选;并且烟草COMT与Lc COMT在进化树上显示出较近的亲源关系,所以烟草可能是LCCOMT相对更好的遗传转化受体;结果可为COMT基因的遗传进化研究、川芎COMT的功能验证及转基因植物培育等奠定理论基础.(图4表2参33)     

苋菜蓝光受体基因AmCRY1密码子使用模式及分析

为了解苋菜AmCRY1基因密码子的使用偏好性、与其他物种CRY1基因的同源关系及异源表达受体,利用CodonW与EMBOSS程序及Excel 2017、SPSS 24、Origin 2018等软件,分析苋菜与其他物种中的CRY1基因的密码子使用特性,比较苋菜AmCRY1基因与模式生物的密码子使用频率.结果表明:苋菜AmCRY1基因的密码子的有效密码子数(ENc)值为54.42,GC含量和GC3含量均低于50%,这表明苋菜AmCRY1偏好使用以A/T结尾的密码子,且在其编码区序列中A+T含量大于G+C;苋菜AmCRY1基因中,偏好性较强的密码子有29个(RSCU 1),偏好性最强的有1个(RSCU 2),其中以A/T结尾的密码子有22个,这表明苋菜AmCRY1基因的密码子偏好以A/T结尾,一些氨基酸对密码子的使用具有较强的偏好性;苋菜AmCRY1基因的密码子在ENc绘图中的基因位点更接近期望曲线,说明在进化过程中苋菜AmCRY1基因的密码子偏好性受突变压力的影响较大;苋菜AmCRY1基因的密码子使用偏好性参数与石竹目物种相近,同源关系较近物种密码子使用偏好性具有相似性;从密码子使用频率上分析得出,酵母菌表达系统更适合苋菜AmCRY1的异源表达,模式植物拟南芥、烟草、番茄均可作为苋菜AmCRY1基因的遗传转化受体,同苋菜代谢途径相似的甜菜也可以作为苋菜AmCRY1基因的瞬时表达受体.本研究表明苋菜AmCRY1密码子偏好以A/T结尾且受突变压力影响,结果可为进一步的功能研究尤其是异源表达验证提供参考.(图5表3参35)     

籽粒苋苹果酸酶(NAD-ME)基因密码子偏好性分析

遗传密码子是生命信息的基本遗传单位,每种氨基酸对应1～6个同义密码子.特定物种在长期进化中形成了适应自身基因组环境的密码子使用偏性.运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析自主克隆的籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性,并与马铃薯等7种植物的ME基因密码子偏好性进行比较,以期为该基因在作物遗传改良中选择合适的受体植物提供依据.结果表明,籽粒苋NAD-ME基因偏好于以A或T结尾的密码子,其它几种被比较作物的ME基因也有同样的趋势,但双子叶植物的偏好性更强.基于NAD-ME基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,籽粒苋与马铃薯、拟南芥、葡萄、蓖麻、毛果杨等双子叶植物聚为1类,玉米和高粱这2个单子叶植物聚为1类,预示籽粒苋NAD-ME基因更适合导入马铃薯等双子叶植物.对籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性与大肠杆菌和酵母的基因组密码子偏好性进行比较,发现均存在差异,与大肠杆菌的差异高于酵母,表明酵母表达系统要优于大肠杆菌表达系统.若要进一步提高籽粒苋NAD-ME基因在大肠杆菌或酵母中的表达水平,尚需对其密码子进行优化.     

苋菜AmMYB2基因密码子偏好性与进化分析

为了解苋菜AmMYB2基因的密码子使用偏好性、与不同物种中调控色素相关的R2R3-MYB基因的同源关系及异源表达受体,利用Codon W与EMBOSS程序及Excel、SPSS、Origin等软件,分析苋菜与其他物种中调控色素代谢的R2R3-MYB基因的密码子使用偏好性,比较苋菜AmMYB2基因与模式生物的密码子使用频率.结果显示:苋菜AmMYB2基因中,所有密码子的GC、GC1、GC2、GC3含量均低于50%,偏好性较强的密码子有17个(RSCU 1),偏好性最强的有7个(RSCU 2),其中以A/T结尾的密码子有19个,表明苋菜AmMYB2基因的密码子偏好以A/T结尾,一些氨基酸对密码子的使用具有较强的偏好性;苋菜AmMYB2基因密码子的有效密码子数(Effective number of codons,ENC)值为49.63,苋菜AmMYB2基因的密码子在ENC绘图中的基因位点更接近期望曲线,说明在进化过程中苋菜AmMYB2基因的密码子偏好性受突变压力的影响较大;苋菜基因与甜菜色素代谢相关的R2R3-MYB基因的密码子使用偏好性参数相近,同源关系较近物种密码子使用偏好性具有相似性;从密码子使用频率上分析得出,酵母菌表达系统更适合苋菜AmMYB2基因的异源表达,模式植物拟南芥、烟草、番茄均可作为苋菜AmMYB2基因的遗传转化受体,同苋菜代谢途径相似的甜菜也可以作为苋菜AmMYB2基因的瞬时表达受体.本研究可为苋菜AmMYB2基因功能的进一步研究提供重要参考.(图5表2参31)     

外来入侵物种的基因签名及其遗传多样性聚类分析

密码子的使用频率分布能够反映一定的生物特性,因而可作为一种基因签名。本文使用CGR方法来研究外来入侵物种不同组织序列的基因签名及遗传多样性聚类分析,首先得出了刺花莲子草(Alternanthera pungens),紫茎泽兰(Ageratina adenophora),水葫芦(Eichhornia crassipes),微甘菊(Mikania micrantha),土荆芥(Chenopodium ambrosioides),一枝黄花(Solidago canadensis)等6种外来入侵植物的31条序列核苷酸字串长k=1到k=6的情况,并选取k=3,即基因序列的密码子,作为生物特性的一个重要表达。并且构造序列间的CGR欧式距离,进而对外来入侵植物序列遗传多样性进行了聚类分析。通过对所获得的6种外来入侵植物的31条序列的基因签名,得出如下结果：CGR是一种简便且计算量小的方法,且基于CGR方法的基因签名,具有典型的生物特性;入侵植物的基因序列在密码子的使用上是非均衡的,且物种亲缘关系近的,则基因签名相似越高;而且基因签名也揭示出了密码子的第三位碱基偏好使用碱基T的现象,与一般物种密码子第三位碱基偏好G/C情况有强烈反差。此外,从获得的6个物种的31条序列聚类谱系图可以直观看出,入侵植物间存在着一定的亲缘关系,遗传多样性较丰富。由于我们所建立的基于CGR方法的基因签名,不仅能够反映植物特性和进化关系,而且能揭示序列中密码子和碱基的偏好使用情况,因而该方法有利于对外来入侵物种的遗传多样性分析、风险评估及预防控制等提供科学依据。     

3种木薯全基因组的密码子偏好性模式与变异来源比较

密码子偏好性研究有利于了解基因表达特征、探索遗传进化规律及为分子育种提供依据.综合运用Perl语言和Codon W1.4.2、SPSS23.0等软件,系统分析3种木薯基因组的编码基因序列,从而得出密码子使用特征并明确影响密码子使用的变异来源.结果显示,3种木薯基因组的密码子在使用模式上具有较高的相似性:总碱基组成在3种木薯中差异较小,都是A/T含量较高,而G/C含量较低,且均偏好使用A/T结尾;通过RSCU(同义密码子相对使用度)值比较分析发现,3种木薯有27个共同的偏好密码子,其中以A/T结尾的密码子达85%以上;RFSC(同义密码子相对使用频率)值显示出3种木薯具有14个相同的高频密码子;其基因的异源表达受体优先选择拟南芥、烟草和毛果杨;密码子偏好性主要受自然选择影响,同时也受到突变压力等其他因素的影响.本研究表明3种木薯基因组的密码子使用模式高度相似且主要受自然选择影响,结果可为将来研究木薯的进化规律和提高外源基因表达效率提供重要依据.(图5表4参40)     

两栖动物线粒体基因组tRNA基因重复、丢失及其影响

在脊椎动物线粒体基因组中,偶有tRNA基因重复或丢失事件发生,这些事件因与相应氨基酸转运密切关联而凸显重要.两栖类中,这些重复或丢失相对多样,可为相关研究提供良好素材.为了解这些事件对氨基酸对应的密码子使用偏好是否产生影响,本文引入统计方法,检测10种两栖类mtDNA蛋白编码基因相对的同义密码子使用度(RSCU),并特别设计将发生tRNA基因重复或丢失物种与其近缘群进行对比分析.结果显示,tRNA基因的重复对密码子使用偏好没有显著的影响,推测可能与突变积累的时限和mtDNA紧凑性有关.另外,tRNA基因丢失也未使相应氨基酸密码子使用偏好产生明显的改变.推测在两栖类中,"tRNA转入"和"tRNA反密码子摆动位点的超级摆动"可能是tRNA基因丢失的补偿方式.     

盐胁迫下真盐生植物与泌盐植物的渗透调节物质及其贡献的比较研究

分别用含有0、100、200、400 mmol L-1 NaCl的Hoagland培养液处理真盐生植物海蓬子(Salicornia europaea)、盐地碱蓬(Suaeda salsa),含有0、100、200 mmol L-1 NaCl的Hoagland培养液处理泌盐植物二色补血草(Limonium bicolor)、滨藜(Atriplex spongiosa)、獐毛(Aleuropus sinensis)和隐花草(Crypsis aculenta)幼苗.处理一定时间后测定其鲜重、干重、有机干重、有机和无机渗透调节剂、渗透调节能力、渗透势、c(Na)/c(K)、c(Suc)/c(SS)等.结果发现,在较适盐度下,实验植物的干鲜重、有机干重和含水量均随盐度增高而增大,而在高盐度下则大部分植物受到抑制.双子叶植物和单子叶植物的无机渗透调节剂Na+、Cl-含量均随盐度升高而增大,双子叶植物的增幅大于单子叶植物,c(Na)/c(K)也高于单子叶植物.双子叶盐生植物的有机渗调剂在渗调中的贡献随外界盐度的升高而降低,而单子叶盐生植物则相反,其可溶性糖含量远高于双子叶植物,蔗糖含量尤其突出,c(Suc)/c(SS)也大于双子叶植物.双子叶植物的渗透调节能力大于单子叶植物,真盐生植物的渗透调节能力大于泌盐植物.另外,6种植物的实测渗透势大于计算渗透势,证明实验植物中还有一些未测定的渗透调节物质.本文还讨论了双子叶植物与单子叶植物、真盐生植物与泌盐植物在渗透剂、渗透调节能力、c(Na)/c(K)、c(Suc)/c(SS)存在区别的可能原因.图3 表4 参24     

使用安捷伦7000A三重串联四极杆GC/MS/MS系统测定大气颗粒物中的硝基多环芳烃

采用毛细管GC结合安捷伦7000A三重串联四极杆GC/MS(G7010AA)系统的多反应监测(MRM)模式分析了大气颗粒物中的硝基多环芳烃(nitro-PAHs).传统硝基多环芳烃的分析方法是在样品前处理之后,使用单四极杆GC/MS的选择离子监测SIM模式或者多维GC/MS,但基于MS/MS检测模式超强的选择性,可直接分析大气颗粒物的粗提物.实际样品中的硝基多环芳烃可以检测到pg·μL-1的级别,相对应于大气样品中pg·m-3级的含量.     

麻疯树胚乳类F-盒蛋白基因的克隆和载体构建

通过随机测序从本实验室构建的麻疯树胚乳cDNA文库中获得了一条与多种植物、动物F-盒家族(F-box)序列相似的EST序列,并进一步克隆得到含有完整编码框的cDNA全长和基因组序列(Jc-Fbl1).Jc-Fbl1cDNA全长1672bp,开放阅读框为1224bp,编码的蛋白质含有407个氨基酸残基.Jc-Fbl1推导的氨基酸序列与拟南芥、水稻中的同源F-box蛋白相似性分别为52%和75%;与人、斑马鱼、线虫等动物的F-box蛋白的相似性达到48%~56%.应用Pfam Search寻找功能结构域,发现其除了含有F-盒家族类结构域外,还有富含亮氨酸重复单位(leucine-rich repeats,LRRs).比对Jc-Fbl1的基因组序列和cDNA序列,发现Jc-Fbl1有两个长度分别为331bp和893bp的外显子和一个长362bp的插入序列,符合内含子的GT-AG法则,认为是Jc-Fbl1的内含子.水稻、拟南芥基因组中的同源序列也出现了这种两个外显子、一个内含子的结构,且内含子位置较为保守.为了进一步研究麻疯树F-box蛋白的功能,构建了同时含有Jc-Fbl1完整开放阅读框序列和绿色荧光蛋白标签的真核表达载体pBI121-Jc-Fbl1-GFP,并经酶切鉴定构建成功.     

福州宦溪野生蕉CBF7的cDNA与启动子克隆及在不同温度下的表达特性

CBF(CRT/DRE-binding factor)在植物低温响应及抗寒性的形成中起着重要的作用.香蕉基因组中只包含有1个CBF7基因,以香蕉基因组序列为参考,采用同源克隆的方法,从福建宦溪野生蕉(Musa itinerans)叶片中克隆CBF7-1基因的c DNA全长序列及其启动子序列.生物信息学分析显示宦溪野生蕉的CBF7-1具有植物CBF家族的典型AP2结构域,物种间序列特异性强;启动子富含多种类型的顺式作用元件,并且具有Cp G岛.q PCR分析表明CBF7-1在28℃时表达量最高,随着温度降低表达量逐渐下降,但在0℃时反而又升高.这表明宦溪野生蕉的CBF7-1可能与低温胁迫、耐热性均相关.     

基于中华猕猴桃“红阳”转录组序列开发EST-SSR分子标记(英文)

为开发猕猴桃EST-SSR标记,了解28个品种猕猴桃间的遗传多样性和遗传关系,对中华猕猴桃"红阳"的转录组序列进行分析,并根据分析结果设计SSR引物.之后采用CTAB法提取28个品种猕猴桃的DNA作为SSR-PCR的扩增模板,并根据扩增结果进行聚类分析.研究中共得到包含SSR的序列21 848条,其中重复单元为单碱基、双碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的序列分别为1 642、15 965、3 141、248、368和484条,随机选择其中46条序列设计SSR引物.根据初步的PCR扩增,筛选出32对条带较少且明亮的引物分别对28个品种猕猴桃的DNA样本进行扩增,并对引物对应的SSR序列进行定位.结果显示,32对引物对应的序列中有19条能够得到完整的所在基因、染色体以及染色体中具体位置的信息.这些引物中有26对具有多态性,共统计到等位基因120个,每对引物得到1-11个等位基因,平均3.75个.28个猕猴桃品种之间的遗传相似性系数在0.53-0.97之间,在遗传相似系数为0.72的水平上,可将它们分为5大类,分类结果与传统形态学的划分基本一致.本研究揭示的各样本间的遗传关系可为未来猕猴桃的种质改良提供依据.图4表5参33     

龙眼miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚中的表达模式

MicroRNA403(miR403)为双子叶植物特有的miRNA家族,其在双子叶植物抗病、逆境胁迫和生长发育中具有重要作用.为了解miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚发生过程中的表达模式,利用psRNAtarget对miR403潜在靶标进行预测,采用改良RLM-RACE技术验证其裂解位点,通过qPCR技术检测miR403及其候选靶标对外源激素的应答及在龙眼体胚中的表达模式.结果显示,共获得41个龙眼miR403的潜在靶标,包含4个PPR(Pentatricopeptide repeat protein)和3个PCNT115(Auxin-induced protein PCNT115),却未发现AGO2(Argonaute2).4个PPR中Dlo_014588.1和Dlo_014589.1序列一致,而3个PCNT115基因序列在所预测的miR403结合位点上下游序列基本一致.裂解位点显示,miR403不具备裂解AGO2 mRNA的能力,但介导PPR(Dlo_014588.1)和PCNT115 mRNA的裂解,裂解位点位于miR403 5′端的第2和第3个碱基之间. qPCR显示,miR403响应脱落酸(ABA)信号并显著上调,PPR和PCNT115对不同浓度的ABA呈现不同的表达模式,PPR和PCNT115在5μg/L ABA时显著上调,随后,PPR先显著下调(50μg/L ABA),而后显著上调(5 000μg/L ABA),而PCNT115呈显著下调趋势;miR403不响应赤霉素(GA3)信号,而PPR和PCNT115随着GA3浓度升高而上调;miR403可以响应不同浓度的水杨酸(SA)和2,4-D信号显著下调,而其靶基因显著上调.不同胚性培养物中qPCR显示,miR403仅在龙眼胚性愈伤组织(EC)高度表达且在龙眼体胚发生过程中显著下调,PPR在EC和子叶胚(CE)高度表达,PCNT115在CE和成熟胚(ME)高水平表达,三者之间并未呈现明显的负调控趋势.本研究表明在龙眼体胚中miR403并不靶向调控AGO2,而是调控PPR和PCNT115;另外,miR403可能响应ABA、SA和2,4-D调控PPR和PCNT15参与到龙眼体胚发生过程中.(图5表2参48)     

野生蕉miR395a前体克隆与进化特性及启动子分析

植物miR395参与硫代谢调控,并在应答逆境胁迫等方面起重要调控作用.为了解香蕉miR395的分子特性和进化规律,在参考香蕉基因组信息的基础上,结合RT-PCR技术,从三明野生蕉(Musa itinerans)叶片中获得81 nt miR395a前体序列,包含21 nt miR395a成熟体序列.进化特性分析表明,植物miR395a前体存在于27个物种中,野生蕉pre-miR395a序列与双子叶耧斗菜(Aquilegia viridiflora Pall.)最为接近,与单子叶的水稻、玉米、高粱最远,表明野生蕉pre-miR395a的起源比较特殊;前体序列长度差异较大(57-226 nt);miR395a成熟体序列分析发现,来自5p臂上的miR395a序列特异性较大.野生蕉miR395a前体能形成典型的发卡结构,miR395a成熟体位于前体的3p臂上.转录起始位点分析表明,野生蕉pri-miR395a转录起始区域位于-87 bp--38 bp,A为转录起始位点.启动子顺式作用元件预测分析表明,野生蕉miR395a启动子包含多个激素、胁迫、生物钟及光响应元件,可能与响应胁迫密切相关.qPCR检测结果也发现miR395a的表达量在低温胁迫下极显著下调,表明响应低温胁迫.综上表明三明野生蕉在响应低温胁迫过程中miR395a起着重要调控作用,这对于进一步研究野生蕉miR395a在低温胁迫中的作用机制具有参考价值.     

抗禾谷孢囊线虫基因中核苷酸结合位点区(NBS)-亮氨酸重复序列区(LRR)的克隆与序列分析

根据源于节节麦抗禾谷孢囊线虫基因Cre3及已经克隆的NBS-LRR类植物抗病基因的NBS与LRR区保守序列分别设计特异引物,从易变山羊草基因组中PCR扩增得到两个扩增条带,它们的大小分别约为530bp和1200bp.经克隆测序发现,这两个序列分别长为532bp和1175bp,且是连续的.它们有32bp的共同序列,总长为1675bp,包含了一个NBS-LRR区和一个不完整的开放阅读框,没有起始密码子、终止密码子和内含子结构.它编码一个557个氨基酸的蛋白质,分子量(Mr)为63.537×103,含有NBS区保守模体ILDD,ESKILVTTRSK,KGSPLAARTVGG,RRC-FAYCS,EGF,以及LRR区的保守模体aXXLXXLXXL.它与Cre3的核苷酸和氨基酸同源性分别为87.8%和77%,可能是一个抗禾谷孢囊线虫基因.图6参13     

西番莲查尔酮合成酶(CHS)基因家族全基因组鉴定及表达模式北大核心CSCD

为了解西番莲(Passiflora edulis Sims f.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因家族的分子进化特性及其在果皮着色与非生物胁迫中的功能,从Pfam数据库下载CHS蛋白HMM模型,并使用HUMMER 3.0、Blast工具和CDD-search鉴定出西番莲基因组中的CHS基因.采用TBtools、EXPASy、MEGA 7.0、MEME、PRAB、SWISSMODEL和PlantCARE等软件对其氨基酸与碱基序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR的方法检测西番莲CHS(PeCHS)基因家族成员进行表达模式分析.研究结果显示西番莲基因组中共有11个PeCHS基因家族成员,分布在6条染色体上,可分为4个亚族,基因结构分析显示2个PeCHS(PeCHS5和PeCHS9)基因具有3个外显子,其他PeCHS基因只具有2个外显子.西番莲物种内共线性分析结果显示两个PeCHS基因对具有片段重复特征:PeCHS3-PeCHS6和PeCHS7-PeCHS9.多物种共线性分析结果显示,只有PeCHS10基因与其他物种具有进化关系.启动子顺式作用元件分析表明该基因家族成员启动子上含有大量逆境胁迫和激素、响应元件.qRT-PCR结果显示PeCHS基因在紫色果皮中的表达量明显高于黄色果皮,且大部分PeCHS基因的表达量在紫色西番莲果皮转色后显著增加.此外,分别有5个(PeCHS3、PeCHS4、PeCHS6、PeCHS8、PeCHS10)和6个(PeCHS1、PeCHS3、PeCHS4、PeCHS7、PeCHS8、Pe CHS11)基因的表达量在高温与低温胁迫下显著提高.本研究表明西番莲的CHS家族成员序列相对保守,并且部分成员可能在果皮花青素积累与温度胁迫中发挥重要作用.(图10表4参53)     

甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1的克隆与原核表达

脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶.根据Genbank上已知的植物FAE1基因设计引物,以从甘蓝型油菜叶片中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增,获得了1380bp的片段.回收该片段,并连接到pMD18-T载体测序.序列比对结果说明了该片段与植物中已知的FAE1序列有极高的相似性,并且不存在内含子序列.将该片段通过高保真酶扩增,EcoRⅠ酶切消化后定向克隆到pGEX-2T表达载体中,在IPTG诱导下于28℃表达出Mr76×103的蛋白质条带.用兔抗GST多克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,并获得阳性检测结果.这为甘蓝型油菜脂肪酸链延长酶基因FAE1功能的进一步研究奠定了基础.图4表1参14     

假单胞菌反式氯双烯内酯异构酶基因克隆和序列分析

从土壤中分离得到一株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株GT241-1,从该菌株中克隆出参与降解2,4-二氯酚的反式氯双烯内酯异构酶基因(dcpE).克隆策略是采用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子.经序列测定得知,dcpE基因编码区1062bp.核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明,dcpE与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异.图5表1参12     

无指盘臭蛙皮肤抗菌肽Odorgrin A真核表达载体的构建与转化

根据无指盘臭蛙(Odorrana grahami)皮肤抗菌肽Odorgrin A的氨基酸序列,合成了以酵母偏爱密码子编码的Odorgrin A基因片段.目的片段从合成质粒上用XhoΙ和EcoRΙ双酶切下后,与经同样限制酶酶切的pPIC9K载体连接而成表达载体pPIC9K-Odo A.PCR扩增、酶切及测序检测的结果表明表达载体构建成功.线性化的pPIC9K-OdoA经电击法转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115宿主菌,营养缺陷型筛选、遗传霉素抗性筛选、PCR扩增和测序检测的结果表明,表达载体pPIC9K-Odo A成功地转化并整合入酵母基因组.用甲醇对具遗传霉素G418高抗性的Odorgrin A重组酵母菌进行诱导表达,取酵母发酵液上清经SDS-PAGE电泳检测,结果初步表明,整合进酵母基因组的抗菌肽Odorgrin A基因已获得分泌表达,表达产物相对分子质量为3×103～4×103,与理论值相近.图10参17     

利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育的研究

采用16S-23S rDNA间隔区段(IGS)PCR-RFLP与16S rRNA基因部分序列分析的方法对饭豆根瘤菌进行了遗传多样性及系统发育分析.由16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析可知,所有菌株在52%的相似性水平上聚在一起,形成了慢生型菌群与快生型菌群这两大菌群.群Ⅰ中,在79%相似性的水平上分为ⅠA与ⅠB两个分支.群Ⅱ中,在62%相似性的水平上分为ⅡA与ⅡB两个分支,分支ⅡA在72%的相似性水平上进一步分为ⅡA1、ⅡA2和ⅡA3三簇;分支ⅡB中的饭豆根瘤菌与标准菌株USDA205T聚在一起,表现的差异并不大.由16SrRNA基因部分序列分析结果可知,供试的4个代表菌株分别位于不同的系统发育分支中.CYR4243与Sinorhizobium fredii的模式菌株USDA205T的序列相似性达到了99.87%.HCY1101与Rhizobium leguminosarum中的三叶草生物型(bv.trifolii)和豌豆生物型(bv.viceae)这两个生物型的参比菌株亲缘关系最近,序列相似性为100%.HCY5202与R.galegae亲缘关系最近,序列相似性为99.86%.CYY3302与Bradyrhizobium elkanii的参比菌株USDA86有最近的亲缘关系,序列相似性近似于100%.图4表1参13