我国蚕豆根瘤菌的多样性和系统发育研究

采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP、IGS PCR-RFLP等方法对分离自我国11个省的50株蚕豆根瘤菌及11株参比菌株进行了表型测定和遗传型研究,同时对5株蚕豆根瘤菌的代表菌株进行了16S rDNA全序列测定.表型测定的结果表明,在80%的相似水平上供试菌株分为4个群,各群间存在地区交叉;16S rDNA PCR-RFLP的聚类结果与数值分类的聚类结果有很好的一致性;IGSRFLP反映的多样性更明显,形成的遗传群较多,可用于菌株间的鉴别.实验结果表明我国蚕豆根瘤菌具有极大的表型多样性和遗传多样性.系统发育研究结果表明,蚕豆根瘤菌的代表菌株均位于快生根瘤菌属(Rhizobium)系统发育分支,与R.leguminosarum USDA2370的全序列相似性达99.9%,说明蚕豆根瘤菌属于Rhizobium,系豌豆根瘤菌的一个生物型.图4表3参12     

四川省部分豆科植物根瘤菌的遗传多样性

从四川省豆科植物鸡眼草属、合欢属、豇豆属、葛属、金合欢、杭子梢分离获得了103株根瘤菌,采用AFLP、BOXAIR-PCR研究了这些菌株的遗传多样性.结果表明,分离自四川省豆科植物6个属的根瘤菌存在明显的遗传多样性,AFLP分析中,全部供试菌株的相似性为21%,全部供试菌株可分为26个AFLP遗传群;BOXAIR-PCR聚类分析结果表明,103个菌株分在70%相似性水平处,供试菌株被分为18个BOX遗传群.除部分菌株外,多数根瘤菌按宿主类型聚群,同一宿主而地理来源不同的根瘤菌分布于不同的遗传群,表明宿主和地理环境对根瘤菌具有深刻影响.图3表1参9     

四川盆地大豆根瘤内生细菌的分离鉴定及促生效果

以四川盆地大豆根瘤为材料,采用划线法分离内生细菌、16S rDNA PCR-RFLP分析其遗传多样性,并结合菌株促生特性和盆栽试验筛选优良促生菌.从分离获得的130株内生细菌中选取了40株细菌作为供试菌株,16S rDNA序列表明分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium).以大豆为供试作物筛选出了12株具有促生能力的细菌,所有菌株均能分泌吲哚-3-乙酸(IAA),浓度达到0.353-32.404μg/mL;7株能产铁载体,活性单位为7.35%-34.31%;有11株具有溶磷能力,溶磷量达到4.26-10.6μg/mL;6株具有固氮能力.接种12株供试菌株后,玉米的农艺性状、植株全氮和全磷含量均优于单施化肥处理,其中菌株DA16-5效果最好,表现出良好的促生潜力.综上,四川盆地大豆根瘤内生菌遗传多样性丰富并且普遍具有促生能力,是重要的生物资源.     

四川盐边植烟土壤放线菌的遗传多样性及抗菌活性

从四川省盐边县代表性烟草种植区域的植烟土壤样品中分离出52株放线菌菌株,采用16S rDNA限制性片段长度多态性(16S rDNA-RFLP)和16S rDNA序列分析研究了其遗传多样性及系统发育地位,并初步探索了其抗菌活性.16S rDNA-RFLP分析结果表明,在非加权组平均法(UPGMA)聚类图中,所有菌株在75%的相似水平上聚为一类,而在88%的相似水平上分为8个遗传类型.在主成分分析聚类图中,供试菌株可分为5个类群,揭示了植烟土壤放线菌菌株具有一定的遗传多样性.代表菌株系统发育分析显示,供试菌株均属于链霉菌属(Streptomyces),链霉菌是植烟土壤中的绝对优势放线菌.初筛结果显示,共有13株菌株表现出了一定的抗菌活性,而在复筛中仅有3株表现较好.根据初筛和复筛结果选择菌株SAUAS3-2进行玉米盆栽试验,结果表明,该菌株具有一定抗菌活性的同时还具有促生作用.本研究揭示了盐边县植烟土壤具有丰富的放线菌资源.     

慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关系的研究

选用包括6株花往根瘤菌[Bradyrhizobium sp.(Arachis)]在内的13株慢生根瘤菌，进行了6种豆科植物结瘤试验及共系统发育分析。研究结果表明，慢生根瘤菌与试验的豆科宿主植物间普遍存在交叉结瘤，还发现有些菌株在原宿主外的豆科植物根部形成类根瘤的现象。16S rDNA和23S rDNA的PCR－RFLP分析揭示出这些菌株rDNA基因的差异性，不同宿主来源的慢生根瘤菌株可以同属一个rDNA类型，而从同一宿主中分离的根瘤菌菌株可分属多种不同的rDNA类型，研究结果表明，采用rDNA PCR-RFLP等遗传背景分析的手段，可能筛选出广谱的根瘤菌力株，表4参8。     

DNA同源性分析最终确定新疆中华根瘤菌（Sinorhizobium xinjiangensis）为一独立种

针对S.xinjiangensis分类地位的争议，从新疆再次分离获得34株快生大豆根瘤菌，在16SrDNAPCR-RFLP分析和SDS全细胞蛋白电泳分群的基础上，进行了16SrDNA全序列相似性和DNA同源性分析.所测4个菌株和S.fredii模式菌株USDA205的16SrDNA全序列有很高的相似性.而DNA同源性分析说明新分离的菌株代表与原定的S.xinjiangensis为一个DNA同源群.其模式菌株CCBAU110与S.fredii的2株参比菌株USDA194、2048之间的DNA同源性分别为31.5%和28.7%.S.fredii的模式菌株USDA205与新分离的菌株代表及原定的S.xinjiangensis的模式菌株和2个参比菌株之间的DNA同源性为20.8%～39%，远低于70%.属于种水平上的差异.按照国际细菌分类委员会以DNA同源性≥70%且△Tm≤5℃作为定种的标准，S.xinjiangensis是Sinorhizobium属中不同于S.fredii的一个独立的种.表3参20     

利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育的研究

采用16S-23S rDNA间隔区段(IGS)PCR-RFLP与16S rRNA基因部分序列分析的方法对饭豆根瘤菌进行了遗传多样性及系统发育分析.由16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析可知,所有菌株在52%的相似性水平上聚在一起,形成了慢生型菌群与快生型菌群这两大菌群.群Ⅰ中,在79%相似性的水平上分为ⅠA与ⅠB两个分支.群Ⅱ中,在62%相似性的水平上分为ⅡA与ⅡB两个分支,分支ⅡA在72%的相似性水平上进一步分为ⅡA1、ⅡA2和ⅡA3三簇;分支ⅡB中的饭豆根瘤菌与标准菌株USDA205T聚在一起,表现的差异并不大.由16SrRNA基因部分序列分析结果可知,供试的4个代表菌株分别位于不同的系统发育分支中.CYR4243与Sinorhizobium fredii的模式菌株USDA205T的序列相似性达到了99.87%.HCY1101与Rhizobium leguminosarum中的三叶草生物型(bv.trifolii)和豌豆生物型(bv.viceae)这两个生物型的参比菌株亲缘关系最近,序列相似性为100%.HCY5202与R.galegae亲缘关系最近,序列相似性为99.86%.CYY3302与Bradyrhizobium elkanii的参比菌株USDA86有最近的亲缘关系,序列相似性近似于100%.图4表1参13     

豆科树种刺槐、黄檀、合欢根瘤菌的数值分类及16S rDNA-PCR RFLP研究

测定了从豆科树种刺槐、黄檀、合欢根瘤中分离获得的51个菌株与18株参比菌株的唯一碳源、氮源利用，抗生素抗性，耐逆性和酶活性等132个表型性状，并用MINTS软件进行聚类分析，结果表明，全部供试菌株在59％的相似性水平上分为两大群：一个各为慢生菌群，另一群为快生和中慢生菌群，在85.1%的相似性水平上分为5个亚群，其中亚群4不与任何已知参比菌株聚在一起，可能为新种。同时，表型性状测定结果发现某些菌株对抗生素（300μg／mL）、温度（40℃）有较强抗性，大多数菌株能在较宽的pH值范围内生长（pH5-12），这些具有抗逆特性的菌株为我国西部大中种植豆科植物接种适宜的根瘤菌提供了宝贵的种质资源，在数值分类的基础上，又对47株菌进行了16S rD-NA-PCR RFLP分析，经SPSS软件聚类后，划分为7个亚群，在较大类群的划分上，与数值分类的结果有较好的一致性，16S rDNA-PCR RFLP遗传图谱共有30种类型。表型及遗传型分析结果表明，豆科树种根瘤菌具有极大的多样性，图2表2参14。     

应用AFLP技术对斜茎黄芪根瘤菌遗传多样性的分析研究

采用ＡＦＬＰ指纹图谱分析技术对来自我国不同地区的９５株斜茎黄芪根瘤菌及２４株已知根瘤菌的参比菌一起进行遗传多样性研究．结果表明,在５０％相似性水平上,全部菌株被分为３１个ＡＦＬＰ群,显示出极大的遗传多样性．相关性较高的菌株的聚类结果与先前的表型性状数值分析结果相一致．具相同ＡＦＬＰ指纹图谱的菌株都具有相同的生长速度,且其中大部分菌株来自我国同一地区,同时具很高的表型相似性．此外,本研究表明,ＡＦＬＰ指纹技术具更高的分辩率,更能揭示种内的遗传多样性     

慢生型大豆根瘤菌的遗传多样性研究

采用选择性扩增片断长度多态性 (简称AFLP)DNA指纹技术对来自泰国北部的 2 45株慢生型大豆根瘤菌进行遗传多样性的研究 .通过AFLP图谱揭示出该地区的慢生型大豆根瘤菌有较显著的遗传多样性 .从 2 45株中选择出 92个代表株用计算机进行的树状图分析结果表明 ,所分析的菌株在 82 %的相似性水平上聚类成 8个群 .对这 92个代表株的部分菌株和慢生型大豆根瘤菌的参比菌株进行多聚酶链反应 (PCR)扩增的 16SrDNA的 4种限制性内切酶长度多态 (简称 16SrDNAPCR RFLP)分析 ,得出 2个不同的 16SrDNAPCR RFLP类型的菌株 ,分别与慢生型大豆根瘤菌的参比菌株Bradyrhizobiumjaponicum和Bradyrhizobiumelkanii相同 .图 1表 2参 14